[發明專利]在具有經改造的輸入/輸出的微生物宿主中人乳寡糖的產生

有效

• 申請號: 201680052611.8
• 申請日: 2016-09-12
• 公開（公告）號: CN108026556B
• 公開（公告）日: 2023-01-20
• 發明（設計）人: S·詹尼溫;D·瓦滕伯格
• 申請（專利權）人: 科漢森母乳低聚糖股份有限公司
• 主分類號: C12P19/18
• 分類號: C12P19/18
• 代理公司: 北京北翔知識產權代理有限公司 11285
• 代理人: 孫占華;姜建成

1.用于通過經遺傳修飾的微生物宿主細胞產生包括作為核心三糖的乳-N-三糖II的所需寡糖的方法，包括以下步驟：

-提供經遺傳修飾的微生物宿主細胞，所述宿主細胞

-包含至少一種重組的糖基轉移酶，

-具有至少一種內源性糖輸出蛋白的表達或活性，所述蛋白被修飾從而使得與未經遺傳修飾的宿主細胞相比，所述糖輸出蛋白的表達或活性減少或失活，從而使得與未經遺傳修飾的宿主細胞相比，所需寡糖的前體向培養基中的輸出減少或消除，

-具有至少一種內源性糖輸出蛋白的表達或活性，所述蛋白被修飾從而使得與未經遺傳修飾的宿主細胞相比，所述糖輸出蛋白的表達或活性增加，從而使得與未經遺傳修飾的宿主細胞相比，所需寡糖的輸出增加，

-在允許產生所需寡糖的條件下在培養基中培養所述宿主細胞，由此將所需寡糖轉運到培養基中，并且

-從所述培養基中獲得所需寡糖。

2.權利要求1的方法，其中所述寡糖為人乳寡糖。

3.權利要求1或2的方法，其中所述寡糖選自乳-N-三糖II、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-巖藻戊糖I、乳-N-巖藻戊糖II、乳-N-巖藻戊糖III、乳-N-巖藻戊糖V、乳-N-二巖藻基己糖I、乳-N-二巖藻基己糖II、乳-N-唾液酰戊糖LSTa、LSTb、LSTc、二唾液酰乳-N-四糖、二唾液酰乳-N-新四糖。

4.權利要求1或2的方法，其中所述宿主細胞包含：

-至少一種同源或異源核酸序列，所述序列編碼使得能夠將所需寡糖輸出到培養基中的蛋白，其中所述宿主細胞已經修飾，從而使得所述同源或異源核酸序列的表達為過表達的；和

-至少一種編碼輸出蛋白的內源性核酸序列的缺失、破壞、減少或失活，所述輸出蛋白將所需寡糖的前體輸出到宿主細胞外；和/或

-至少一種編碼蛋白的同源或異源核酸序列的過表達，所述蛋白介導所需寡糖的前體輸入到所述宿主細胞中，其中所述前體大于二糖。

5.權利要求4的方法，其中所述使得能夠輸出所需寡糖的蛋白屬于次級主動轉運蛋白的類別。

6.權利要求4的方法，其中所述使得能夠輸出所需寡糖的蛋白進行包含至少三個部分的寡糖的輸出。

7.權利要求6的方法，其中所述使得能夠輸出所需寡糖的蛋白進行包含作為核心三糖的乳-N-三糖II的寡糖的輸出。

8.權利要求4的方法，其中所述至少一種編碼使得能夠輸出所需寡糖的蛋白的核酸序列是內源性核酸或重組核酸。

9.權利要求4的方法，其中所述編碼使得能夠輸出所需寡糖的蛋白的核酸序列為細菌、古細菌、植物、酵母或動物來源。

10.權利要求4的方法，其中所述至少一種編碼使得能夠輸出所需寡糖的蛋白的核酸序列是選自以下的基因：來自大腸桿菌(Escherichia coli)的yebQ和yjhB，來自產琥珀酸曼氏桿菌(Mannheimia succiniciproducens)的proP，以及來自奈氏西地西菌(Cedeceaneteri)的setA。

11.權利要求1的方法，其中所述重組的糖基轉移酶選自以下中的至少一種：半乳糖基轉移酶、唾液酰轉移酶、N-乙酰葡糖胺轉移酶和巖藻糖基轉移酶。

12.權利要求11的方法，其中所述重組的糖基轉移酶選自以下中的至少一種：β-1,3-N-乙酰葡糖胺轉移酶、β-1,3-半乳糖基轉移酶、β-1,4-半乳糖基轉移酶、β-1,6-半乳糖基轉移酶、α-2,3-唾液酰轉移酶、α-2,6-唾液酰轉移酶、α-1,2-巖藻糖基轉移酶或α-1,3-巖藻糖基轉移酶。