[發(fā)明專利]蛋白質(zhì)保持擴展顯微法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201680051406.X
• 申請日: 2016-08-05
• 公開（公告）號: CN108139408B
• 公開（公告）日: 2020-08-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: P·W·蒂爾伯格;F·陳;E·S·博伊登;C-C·余
• 申請（專利權(quán)）人: 麻省理工學(xué)院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N1/36
• 代理公司: 北京市鑄成律師事務(wù)所 11313
• 代理人: 郗名悅;張波

本發(fā)明提供被稱為蛋白質(zhì)保持ExM(proExM)的方法，其中使用交聯(lián)分子將蛋白質(zhì)，而不是標記物錨定到可溶脹的凝膠。這種proExM策略可用于進行免疫染色細胞和組織以及表達FP的樣品的納米級成像，因為即使當經(jīng)受非特異性蛋白質(zhì)水解消化時，來自直接錨定到凝膠的基因編碼熒光蛋白和/或常規(guī)熒光標記二級抗體和鏈霉親和素的熒光信號得以保持。

相關(guān)申請

本申請要求2015年8月7日提交的美國臨時申請序列號62/202,423的優(yōu)先權(quán)益，其內(nèi)容以引用的方式整體并入本文。

政府資助

本發(fā)明是在由Hertz Foundation、NYSCF、NSF和Rehabilitation Institute ofChicago授予的NYSCF-R-NI10和由NIH和Cargill Fund Bioengineering Fund授予的1-U01-MH106011的政府支持下完成的。政府對本發(fā)明擁有某些權(quán)利。

背景技術(shù)

擴展顯微法(ExM)可以～70nm橫向分辨率來對厚的保存標本成像。使用ExM，通過在成像之前物理擴展生物樣本來規(guī)避光學(xué)衍射極限，從而使亞衍射限制結(jié)構(gòu)達到可通過常規(guī)衍射限制顯微鏡來觀察的尺寸范圍。ExM可以以衍射限制顯微鏡的體素率但是以超分辨率顯微鏡的體素尺寸來對生物標本成像。擴展樣品是透明的，并且與水的折射率匹配，因為擴展材料是99％的水。原始ExM協(xié)議通過使用可凝膠錨定的熒光團標記感興趣的生物分子來運作。然后，在樣品中合成可溶脹的聚電解質(zhì)凝膠，從而它將標記物并入。最后，用非特異性蛋白酶處理樣品以使其機械特性均勻，接著在水中透析以介導(dǎo)聚合物-樣本復(fù)合物的均勻物理擴展。除了可凝膠錨定的標記物以外，ExM所需的所有化學(xué)品都可以購買，這種標記物需要定制合成并且對研究人員采用所述方法造成了障礙。ExM協(xié)議的另一個缺點是基因編碼的熒光團不能在沒有抗體標記的情況下成像。另外，ExM不能在凝膠中保持天然蛋白質(zhì)，并且使用不能廣泛獲得的定制試劑。因此，需要利用ExM來設(shè)計將樣品內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)保持在原位并且加以成像的新方法。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供被稱為蛋白質(zhì)保持ExM(proExM)的方法，其中使用交聯(lián)分子將蛋白質(zhì)，而不是標記物錨定到可溶脹的凝膠。這種proExM策略可用于進行免疫染色細胞和組織以及表達FP的樣品的納米級成像，因為即使當經(jīng)受非特異性蛋白質(zhì)水解消化時，來自直接錨定到凝膠的基因編碼熒光蛋白和/或常規(guī)熒光標記二級抗體和鏈霉親和素的熒光信號得以保持。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于感興趣的樣品的蛋白質(zhì)的保持和成像的方法，其包括以下步驟：使樣品內(nèi)的蛋白質(zhì)與雙官能交聯(lián)劑綴合；使樣品包埋在可溶脹材料中，其中樣品內(nèi)的蛋白質(zhì)錨定到可溶脹材料；使樣品經(jīng)受消化；使可溶脹材料溶脹以形成擴展樣品；并且使感興趣的樣品成像。

附圖簡述

從如在附圖中示出的本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的以下更加具體的描述中將明白本發(fā)明的前述和其它目的、特征以及優(yōu)點，在附圖中相似元件符號指代不同視圖中的相同部分。附圖未必按比例繪制，而是將重點放在示出本發(fā)明的原理上。

專利或申請文件含有至少一幅彩色附圖。在提出請求并支付必要費用后，本事務(wù)所將提供具有彩色附圖的本專利或?qū)＠暾埞嫉母北尽?/p>

圖1：38g/100mL丙烯酸鈉儲備溶液：合適(澄清，左)和低純度(淡黃色，右)。

圖2：是凝膠腔室的示意圖。

圖3a-圖3c：使用高壓滅菌版的組織破壞方案，擴展之前(a)和之后(b)，Thy1-YFP-表達大腦組織的落射熒光圖像(僅綠色通道)。擴展后共焦圖像(c)。擴展組織是使用針對綠色熒光蛋白(GFP，綠色)、GAD65/67(紅色)和SV2(藍色)的一級抗體染色的抗體。比例尺：(a)50um，(b)500um擴展前(2.2mm擴展后)，(c)10um擴展前(44um擴展后)。