[發(fā)明專利]誘導的擴展的多潛能干細胞、制備及使用方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201680047455.6
• 申請日: 2016-08-12
• 公開（公告）號: CN108884436B
• 公開（公告）日: 2021-11-05
• 發(fā)明（設計）人: 鄧宏魁;楊楊;劉蓓;徐君
• 申請（專利權）人: 北昊干細胞與再生醫(yī)學研究院有限公司;北京大學;北京宏冠再生醫(yī)學科技有限公司
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00;C07K14/54;C07K14/715;C12N5/07;C12N5/074;C12N5/0789;C12N5/0797;C12N5/095;C07K16/38;C07K16/40
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 吳小明

用于在體外培養(yǎng)后擴展分離的多潛能干細胞在體內產(chǎn)生胚外譜系的能力的因子(在本文中稱為多潛能性的化學擴展劑(CEP))。擴展多潛能細胞產(chǎn)生胚胎譜系和胚外譜系的能力的方法。待重編程的細胞與有效量的CEP接觸足夠的時間段以將細胞重編程為化學誘導的擴展的多潛能干細胞(ciEPSC)。基于包括以下的性質將ciEPSC鑒定為擴展的多潛能細胞：(i)形態(tài)學上和(ii)功能上，例如基于它們在體內貢獻TE和ICM二者的能力。可以培養(yǎng)或誘導ciEPSC以分化成所需類型的細胞，并且用于許多應用，包括但不限于細胞療法和組織工程。

發(fā)明領域

本發(fā)明總體上涉及用于擴展體外培養(yǎng)的多潛能(pluripotent)干細胞的體內多潛能性的組合物和方法。

發(fā)明背景

早期胚胎中的全潛能(totipotent)細胞是所有干細胞的祖先，并且能夠發(fā)育為整個生物體，包括胚外組織(諸如胎盤)。內細胞團(ICM)中的多潛能細胞是全潛能細胞的后代并且能夠分化成除胚外組織之外的身體的任何細胞類型。

動物發(fā)育通過精子對卵子的受精作用來啟動，緊接著是有絲細胞分裂或卵裂，以產(chǎn)生卵裂球。在大多數(shù)動物中，細胞類型多樣化的第一步是創(chuàng)造原胚層，即內胚層、中胚層和外胚層。通常，內胚層是營養(yǎng)吸收所必需的胃腸道的前體；中胚層產(chǎn)生分別參與運動和心血管循環(huán)的肌肉和血細胞；并且外胚層分別發(fā)育成對于免受環(huán)境危害和感知環(huán)境至關重要的表皮和神經(jīng)元。因此，所述三種胚層的形成為產(chǎn)生動物生命所必需的各種組織奠定了基礎，并且是在動物發(fā)育開始時發(fā)生的進化上保守的事件。

然而，對于哺乳動物的發(fā)育，特別是真哺乳亞綱動物(諸如小鼠和人類)的發(fā)育，情況略有不同。哺乳動物發(fā)育的第一個細胞分化事件不是形成所述三種胚層，而是建立兩種不同的細胞譜系：滋養(yǎng)外胚層(TE)和內細胞團(ICM)。TE通過直接與母親的子宮相互作用來參與著床，并且產(chǎn)生胎盤中的組織。只有在植入之后所述三種胚層才由ICM形成，最終產(chǎn)生動物體內的所有組織。綜述于Marikawa等人,Mol.Reprod.Dev.,76(11):1019-1032(2009)。

ESC(胚胎干細胞)是存在于胚泡的ICM中的多潛能細胞的體外對應物。雖然正在發(fā)育的胚胎中的天然多潛能細胞短暫地存在，但是ESC能夠在體外維持，這提供了未分化細胞的無限來源。Tachiban等人,Cell,148(1-2):285-295(2012)。分離的體外培養(yǎng)的多潛能干細胞的下游應用依賴于它們的潛能，即它們分化成其它細胞類型的能力以及通過它們體外快速擴增細胞的難易度/體外快速擴增細胞的能力。形成畸胎瘤和嵌合體二者的細胞體內分化是評價細胞發(fā)育潛能的基本且可靠的工具。幾項研究已經(jīng)證明培養(yǎng)的多潛能干細胞產(chǎn)生全部三種胚胎胚層的能力(Takashima等人,Cell,158:1254-1269(2014)；Chan等人,CellStem Cell,13:663-675(2013)；Theunissen等人,Cell Stem Cell15:471-487(2014)；Evans等人,Nature,292:154-156(1981)，Li等人,Cell,135:1299-1310(2008)；Buehr等人,Cell,135:1287-1298(2008)；和Thomson等人,Science,282:1145-1147(1998)。然而，體外培養(yǎng)的多潛能干細胞顯示由例如通過形成嵌合體和/或在體內產(chǎn)生胚外譜系的無能性確定的有限/限制的細胞潛能，由通過它們形成嵌合體的無能性/無效性確定的有限的發(fā)育潛能，和/或呈現(xiàn)與體外快速擴增細胞的能力、培養(yǎng)中穩(wěn)定維持細胞有關的限制性，這限制了這些細胞的下游應用。例如，研究表明多潛能細胞，諸如幼稚NHSM(幼稚人干細胞培養(yǎng)基)-hES(人胚胎干)細胞，不能貢獻嵌合小鼠胚胎中的TE(滋養(yǎng)外胚層)和ICM(內細胞團)二者(Gafni等人,Nature,504(7479):282-6(2013))。外胚層干細胞(EpiSC)容易形成畸胎瘤，然而，它們很少形成嵌合體。Han等人,(Cell,143:617-627(2010))描述了EpiSC的亞群，其構成培養(yǎng)物中的約99％(EpiSC)并且顯示未貢獻嵌合體。作為另外的實例，細胞解離后人胚胎干細胞的存活不佳妨礙了進一步的操作和開發(fā)。