[發(fā)明專利]確定血液樣本或抽吸樣本中上皮細胞濃度的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201680046614.0
• 申請日: 2016-08-03
• 公開（公告）號: CN108139400B
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發(fā)明（設計）人: 烏爾里希·帕什曼;卡塔琳娜·帕什曼
• 申請（專利權）人: 烏爾里希·帕什曼;卡塔琳娜·帕什曼
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 北京同立鈞成知識產權代理有限公司 11205
• 代理人: 馬爽;臧建明

1.各自帶有至少一個標記且各自針對上皮細胞粘附分子EpCAM的抗體、抗體片段或抗體模擬物在制備用于確定來源于人或哺乳動物并已與EDTA混合的血液樣本中上皮細胞濃度的方法的試劑中的應用，所述方法包括以下步驟：

a）通過加入引起紅細胞裂解的緩沖液，裂解存在于所述血液樣本中的紅細胞，對在裂解過程中沒有被裂解的細胞進行分離，并將所分離的細胞懸浮于緩沖液中，其中，在所述紅細胞被裂解前，所述血液樣本在0到40℃之間的溫度下儲存24小時；

b）將各自帶有至少一個標記且各自針對所述上皮細胞粘附分子EpCAM的抗體、抗體片段或抗體模擬物添加到從步驟a）得到的細胞懸浮液中，或是添加到所述細胞懸浮液的子量中，其中所述子量是通過分離獲得的，將所述抗體、抗體片段或抗體模擬物與所述細胞懸浮液或所述子量混合，并對得到的混合物進行至少一段時間的溫育，所述至少一段時間是所述抗體、抗體片段或抗體模擬物與所述細胞的結合達到降低的結合率所需要的時間，其中所述溫育至少進行12小時；

c）確定從步驟b）得到的混合物中通過所述抗體、抗體片段或抗體模擬物的結合而標記的細胞的數量；以及

d）計算所述血液樣本中標記細胞的濃度，所述標記細胞的數量已經在步驟c）中確定。

2.根據權利要求1所述的應用，其中，在步驟a）和b）之間執(zhí)行以下其他步驟：

a1）將從步驟a）得到的所述細胞懸浮液分離出另一個子量；

a2）以一定的量將各自帶有至少一個標記且各自針對上皮細胞粘附分子EpCAM的抗體、抗體片段或抗體模擬物添加到所述另一個子量中，使得它們在所述另一個子量中的濃度與如步驟b）所述子量中的所述抗體、抗體片段或抗體模擬物的濃度相等，將所述抗體、抗體片段或抗體模擬物與所述另一個子量混合，并對在預定溫度下得到的混合物進行溫育；以及

a3）以如步驟a2）所述的混合作為起始，隨著時間連續(xù)地或反復地確定已經與所述另一個子量中的細胞結合的抗體、抗體片段或抗體模擬物的量，從中確定結合率，并確定所述抗體、抗體片段或抗體模擬物與所述細胞的結合達到降低的結合率所需的時間；

其中，在所述預定溫度下進行步驟b）中的溫育，其中選擇如步驟b）所述的時間，使其至少與在步驟a3）中確定的時間一樣長。

3.根據權利要求1所述的應用，其中，如步驟b）所述的溫育是在預定溫度下進行的。

4.根據權利要求2或3所述的應用，其中所述預定溫度是在0-30℃范圍內的溫度。

5.根據權利要求1所述的應用，其中如步驟b）所述的溫育進行至少13小時。

6.根據權利要求1所述的應用，其中，所述標記是通過熒光染料產生的熒光標記，是通過生色團產生的顏色標記，或是通過生物素、親和素或鏈霉親和素產生的間接可檢測標記。

7.根據權利要求1所述的應用，其中，通過激光掃描細胞計術或光學顯微術確定如步驟c）所述的通過與所述抗體、抗體片段或抗體模擬物的結合所標記的細胞的數量。

8.根據權利要求2所述的應用，其中通過激光掃描細胞計術或光學顯微術確定如步驟a3）所述的結合的抗體、抗體片段或抗體模擬物的量。

9.根據權利要求7或8所述的應用，其中，通過光學顯微術確定所述結合的抗體、抗體片段或抗體模擬物的量和/或確定所述標記的細胞的數量，并且使用圖像識別軟件鑒定所述細胞。

10.根據權利要求7或8所述的應用，其中所述標記是熒光標記，并且在所述激光掃描細胞計術或所述熒光顯微術中為每個細胞動態(tài)地確定每個細胞的總熒光和該細胞的背景熒光，從而獲得所述細胞的等效熒光值，作為在每種情況下為特定細胞的確定的總熒光和為該細胞的確定的背景熒光之間的差異。

11.根據權利要求1所述的應用，其中通過離心、沉降或過濾執(zhí)行如步驟a）所述的分離。