[發(fā)明專利]確定血液樣本或抽吸樣本中上皮細胞濃度的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201680046614.0
• 申請日: 2016-08-03
• 公開（公告）號: CN108139400B
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發(fā)明（設計）人: 烏爾里希·帕什曼;卡塔琳娜·帕什曼
• 申請（專利權）人: 烏爾里希·帕什曼;卡塔琳娜·帕什曼
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 北京同立鈞成知識產權代理有限公司 11205
• 代理人: 馬爽;臧建明

本發(fā)明涉及一種確定來源于人或哺乳動物并已與抗凝劑混合的血液樣本或抽吸樣本中上皮細胞濃度的方法。本文中，在加入各自針對上皮細胞的特異性抗原的抗體、抗體片段或抗體模擬物后，對所述樣品進行溫育，直至所述抗體、抗體片段或抗體模擬物與所述細胞的結合達到降低的結合率。只有在此時，才能確定所述血液樣本或抽吸樣本中標記的細胞的數量以及所述細胞的原始濃度。

技術領域

本發(fā)明涉及一種確定來源于人或哺乳動物并已與抗凝劑混合的血液樣本或抽吸樣本中上皮細胞濃度的方法。該抽吸樣本可以是骨髓抽吸物、胸腔抽吸物或腹膜抽吸物的樣本。

背景技術

從US 7,615,358 B2中已獲知這種(確定血液樣本或抽吸樣本中上皮細胞濃度的)方法。在該方法中，通過添加抗體或抗體片段對存在于體液中的上皮腫瘤細胞進行標記，所述抗體或抗體片段針對由單克隆抗體HEA 125識別的人體上皮抗原。隨后，將該樣本施加到載體(support)上并對其進行溫育，以使所述腫瘤細胞粘附到所述載體上。關于這一點，所述載體的表面上可以涂覆有支持非特異性細胞結合的試劑，例如聚-L-賴氨酸(poly-L-lysine)。所述細胞的粘附通常需要花費10到15分鐘。在這之后，通過細胞形態(tài)識別粘附的上皮腫瘤細胞中的活細胞，并對其進行量化，計算所述體液中存活的上皮腫瘤細胞的濃度。這涉及到通過激光掃描細胞計術對所述粘附的上皮腫瘤細胞的形態(tài)進行分析，其中通過活腫瘤細胞上特有的表面染色對它們進行檢測，并基于胞內染色(intracellular staining)消除死細胞。

WO2014/047285 A1公開了一種檢測和/或治療可能受益于紫杉烷療法的前列腺癌患者子群的方法。該方法確定從所述患者處采集的樣本中是否存在雄激素受體剪接變體。為實現該目的，可以從所述樣本中捕獲循環(huán)腫瘤細胞，并測試其中是否存在特定剪接變體中的一個。可以通過固定化的抗體實現(所述)捕獲。(所述)測試包括使用針對所述剪接變體的抗體接觸所述樣本，并檢測所述抗體與所述剪接變體的結合。

Pizon M等人于2013年2月在《科學公共圖書館綜合卷(PLOS ONE)》第8卷、第2期、e56836、第1-6頁公開了一種確定乳腺癌患者血液樣本中的循環(huán)上皮腫瘤細胞上的IGF受體I和VEGF受體2的方法。該方法中，在采集后的48小時內用EDTA作為抗凝劑對所述血樣進行處理。此外，所述血樣中的紅細胞被裂解。在4℃下，在晚上對剩余的細胞與經PE標記的針對VEGF受體2的小鼠單克隆抗體以及經FITC綴合的針對EpCAM的小鼠抗體進行溫育，或是在晚上對剩余的細胞與經PE標記的針對IGF受體I的小鼠單克隆抗體以及經FITC綴合的針對EpCAM的小鼠抗體進行溫育。將所得確定體積的細胞懸浮液轉移至ELISA板的孔中，并使用激光掃描細胞計術對其進行測量。

Hekimian K等人于2012年在《臨床和實驗醫(yī)學雜志(Clin.Chem.Lab.Med)》的50(4)的第701-708頁公開了去掩蔽(demask)乳腺癌患者體內循環(huán)的上皮腫瘤細胞上的上皮細胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)的吐溫20(20)療法。該出版物推測EpCAM由糖蛋白或膜脂蛋白掩蔽(mask)，這意味著將阻止抗體的結合。在一實驗中，分別在采集當天、在采集后的第一天和采集后的第二天，每次取1ml抗凝的外周血與20μl的20一起溫育5分鐘，或是不用去污劑(detergent)，取1ml抗凝的外周血溫育5分鐘。之后，用紅細胞裂解緩沖液使其中存在的紅細胞裂解。然后，用針對EpCAM的抗體檢測上皮細胞。實驗發(fā)現，在采集當天、在采集后第一天和采集后第二天，均能夠檢測到在誤差范圍內同樣高的細胞數量。而在沒有20的情況下，在采集當天未能檢測到任何細胞，在(采集后)第一天可能檢測到比經20處理的情況下數量稍少的細胞，并可能在(采集后)第二天檢測到與經20處理的情況下數量一樣多的細胞。這表明，在對血液樣本與所述抗體進行溫育之前對該血液樣本的儲存也會增加細胞上的EpCAM對所述抗體的可性(accessibility)。

發(fā)明內容

本發(fā)明的一個目的是提供一種確定來源于人或哺乳動物并已與抗凝劑混合的血液樣本或抽吸樣本中上皮腫瘤細胞濃度的替代方法。