[發明專利]用于檢測Htert基因的啟動子中的突變的方法，序列，組合物和試劑盒

在審

• 申請號: 201680038603.8
• 申請日: 2016-05-02
• 公開（公告）號: CN109790580A
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發明（設計）人: 安娜·保拉·蘇亞雷斯·迪亞斯·費雷拉;雨果·若奧·馬奎斯·普拉茲雷斯;卡塔里娜·米格爾·阿爾維斯·薩爾加多;魯伊·佩德羅·蒙泰羅·巴蒂斯塔;若奧·佩德羅·里科·德·奧利韋拉·比納格雷
• 申請（專利權）人: 艾帕特瑪普（波爾圖大學分子病理學和免疫學研究所）
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886
• 代理公司: 北京市萬慧達律師事務所 11111
• 代理人: 王蕊;李軼

本發明涉及一種檢測Htert基因啟動子中c.?124C>T和c.?146C>T突變的方法。所述方法使用了反應組合物，其包含擴增引物和用于基因分型的探針。本發明的另一方面涉及引物和探針，其用于以表示為SEQ ID NO.1到SEQ ID NO.6的序列進行前述方法，其表現出對于這些突變的高特異性，以及包含這些引物和探針的組合物。本發明進一步涉及包含上述組合物的試劑盒，其用于通過進行本發明的方法來檢測Htert基因啟動子中的c.?124C>T突變和c.?146C>T突變。本發明的方法、基因序列、組合物和試劑盒可以有利地用于檢測生物樣品中的痕量的c.?124C>T突變和c.?146C>T突變，這是由于其對于這樣的突變的高靈敏性和特異性。本發明因此可以用于與這類突變有關的疾病的早期檢測、鑒別、復發檢測或者預測和監測，例如膀胱癌、甲狀腺癌、鱗狀上皮細胞癌、基細胞癌、黑素瘤、神經膠質瘤和肝細胞癌等，并且最終提供用于限定適當的治療的基礎。因此，本發明涉及醫學、藥學、分子生物學、生物化學和人類遺傳學的技術領域。

技術領域

本發明涉及一種超靈敏檢測Htert基因啟動子中的c.-124C>T和c.-146C>T突變的方法，包含用于擴增的引物和用于基因分型的探針的反應組合物，被稱作SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6的序列(其被設計來顯示對于這些突變的高特異性)，以及包含用于進行所述方法的這類組合物的試劑盒。

本發明可以有利地用于檢測生物樣品和體外存在的痕量的這類c.-124C>T和c.-146C>T突變，這歸因于所述方法的高靈敏性和所產生的基因序列的特異性，并且由此允許與那些突變相關的疾病的早期檢測，復發鑒別或者預測和監測，例如膀胱癌、甲狀腺癌、鱗狀上皮細胞癌、基細胞癌、皮膚癌、中樞神經系統癌和肝細胞癌等，并且最后提供適當的治療設置的基礎。

因此，本發明落入醫學，藥學，分子生物學，生物化學和人類相關遺傳學的技術領域。

背景技術

在DNA復制(其先于有絲分裂)過程中發生的體細胞突變是某些人類疾病的源頭，特別是某些類型的癌癥的源頭。在高百分比(大約75-80％)的腫瘤細胞系中觀察到存在著酶端粒末端轉移酶。最近，本申請人已經鑒別了編碼這種酶的端粒末端轉移酶基因——TERT基因——的啟動子中的突變，特別是在位置c.-124C>T和c.-146C>T(從初始ATG起算)處的突變。這些突變與幾個惡性腫瘤有關，例如中樞神經系統癌(43-51％)，膀胱癌(59-66％)，肝細胞癌(59％)，甲狀腺癌(10％)，皮膚癌(黑素瘤29％-73％，73％基細胞癌(BCC)和鱗狀上皮細胞癌(SCC)45％)和胃腸道間質腫瘤(GISTs)(4％)[1-7]。

端粒末端轉移酶啟動子突變以相對較高的頻率存在于某些癌癥中的事實使得它們是用于早期檢測，診斷，預后，復發檢測或者預測/監測腫瘤的治療響應的潛在生物標記物，例如中樞神經系統腫瘤，膀胱癌，肝細胞癌，甲狀腺癌和皮膚癌等。例如在膀胱癌中，在端粒末端轉移酶基因的位置c.-124C>T和c.-146C>T(從ATG起算)處的體細胞突變是普遍的，其達到了85％，并且與在成纖維細胞生長受體3(FGFR3)基因中的突變R248C和S249C[9]一起為用于膀胱癌的最可靠的生物標記物。

但是，對于體外使用的生物樣品液體(例如尿，血漿，腦脊液，抽吸細胞學(aspiration cytology)等)，在端粒末端轉移酶基因的位置c.-124C>T和c.-146C>T(從ATG起算)的突變檢測方法必須具有高的分析靈敏性，來檢測痕量的突變等位基因，甚至當它們在樣品中被更豐富的“野生型”等位基因“稀釋”時更是如此。