[發明專利]制造適于向體細胞分化誘導的干細胞克隆的方法

有效

• 申請號: 201680034787.0
• 申請日: 2016-04-14
• 公開（公告）號: CN107709543B
• 公開（公告）日: 2021-11-09
• 發明（設計）人: 江藤浩之;遠藤大;重盛智大
• 申請（專利權）人: 國立大學法人京都大學;株式會社美加細胞
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00;C12N15/00;C12N15/09
• 代理公司: 北京銘碩知識產權代理有限公司 11286
• 代理人: 楊敏;金玉蘭

本發明提供一種方法，該方法是制造干細胞克隆的方法，包括：(i)將與向體細胞的分化誘導相關的外源性基因導入到干細胞的工序；(ii)將導入有外源性基因的干細胞分化誘導為上述體細胞的工序；(iii)將分化誘導而成的體細胞進行脫分化的工序；以及(iv)從通過工序(iii)形成的干細胞集落，分離出上述外源性基因整合到染色體而成的干細胞的工序。

技術領域

本發明涉及使利用了體細胞的重編程并由各種集團構成的干細胞或體細胞進行來源于單一細胞的細胞集團化，即克隆化的方法等。

背景技術

在細胞株研發中，克隆是重要的工序，以往，該克隆利用有限稀釋法來進行。

雖然通過向細胞導入外源性基因來進行使細胞向期望的細胞類型變化(專利文獻1、非專利文獻1和非專利文獻2)，但由于導入的外源性基因的拷貝數和/或染色體上的導入部位等不同，所以得到的細胞不一樣。因此，雖然考慮通過有限稀釋法來進行克隆，但未必所有細胞均能夠適用有限稀釋法。

另外，導入外源性基因而得到的細胞即使進行相同的方法，再次得到期望的細胞的概率也低，因此在需要對該細胞進行同源重組等基因操作的情況下，能夠進行這樣操作的細胞類型受到限制。

近年來，提出了由使保有期望的TCR型的T淋巴細胞重編程而得到的iPS細胞再次誘導為T淋巴細胞的補充療法(專利文獻2或非專利文獻3)，但這并不是針對克隆或基因操作。

現有技術文獻

專利文獻

專利文獻1：WO2014/148646

專利文獻2:WO2011/096482

非專利文獻

非專利文獻1：Nakamura S等，Cell Stem Cell.14：535-548,2014

非專利文獻2：Tanaka A等PLoS One.8：e61540,2013

非專利文獻3：Nishimura T等，Cell Stem Cell.12(1)：114-126,2013

發明內容

技術問題

本發明的目的在于，使由各種集團構成的干細胞或體細胞進行來源于單一細胞的細胞集團化，即進行克隆化。

技術方案

本發明人等發現，從經過一次或多次脫分化而制備出的干細胞集落分離出與體細胞的分化誘導相關的基因整合到染色體而成的干細胞，結果分離出的干細胞適于向體細胞分化誘導，從而完成了本發明。

即，本發明提供以下的發明。

一種制造[A1]干細胞克隆的方法，包括：

(i)將與向體細胞的分化誘導相關的外源性基因導入到干細胞的工序，

(ii)將導入有上述外源性基因的干細胞分化誘導為上述體細胞的工序，

(iii)將分化誘導而成的體細胞進行脫分化的工序，以及

(iv)從通過工序(iii)形成的干細胞集落分離出上述外源性基因整合到染色體而成的干細胞的工序。

[A2]在[A1]記載的方法中，分離出的干細胞克隆的向體細胞的分化誘導效率比克隆化前的干細胞的向體細胞的分化誘導效率高。

[A3]在[A1]或[A2]記載的方法中，上述體細胞為造血前體細胞、巨核前體細胞、成紅血細胞、神經細胞、神經干細胞、神經嵴細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、軟骨細胞，肝細胞或黑素細胞。