[發(fā)明專利]復(fù)數(shù)個(gè)標(biāo)的核酸的檢測(cè)套組及使用其的檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201680031912.2
• 申請(qǐng)日: 2016-05-10
• 公開（公告）號(hào): CN107849617B
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 長野隆志;宮島兼佑;楢原謙次
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 美之賀美蒂股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/09
• 代理公司: 北京泛華偉業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11280
• 代理人: 郭廣迅

本發(fā)明提供一種復(fù)數(shù)個(gè)標(biāo)的核酸的檢測(cè)套組，其可使用置入有1種反應(yīng)液的1個(gè)反應(yīng)容器以及單一標(biāo)記，來同時(shí)擴(kuò)增、檢測(cè)復(fù)數(shù)個(gè)基因。疑似含有會(huì)在變性溫度T0下進(jìn)行解離的第1標(biāo)的核酸及第2標(biāo)的核酸的溶液是含有下述組分而成：DNA聚合酶；第1標(biāo)的用引物，其在退火(annealing)溫度T1下，結(jié)合到源自第1標(biāo)的核酸的單鏈；第2標(biāo)的用引物，其在退火溫度T1下，結(jié)合到源自第2標(biāo)的核酸的單鏈；第1標(biāo)的用探針，其在退火溫度T1下，結(jié)合到源自第1標(biāo)的核酸的單鏈；第2標(biāo)的用探針，其在低于退火溫度T1及延長溫度T2的第2標(biāo)的檢測(cè)溫度T3下，結(jié)合到源自第2標(biāo)的核酸的單鏈；且滿足T0T2≧T1T3。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明有關(guān)于改善PCR法，來測(cè)定復(fù)數(shù)個(gè)標(biāo)的核酸的檢測(cè)套組及其關(guān)聯(lián)技術(shù)。

背景技術(shù)

在基因檢查中，有許多需要測(cè)定復(fù)數(shù)個(gè)標(biāo)的基因。例如，流行性感冒的A型與B型、流行性感冒與RSV、更甚者人類間質(zhì)肺炎病毒(human metapn eumovirus)、性感染癥的披衣菌(chlamydia)與淋病球菌(gonococcus)、霉?jié){菌(mycoplasma)及其抗性因子(resistancefactor)等。

在病征相似之下且在同時(shí)期同時(shí)擴(kuò)大感染情況等之下，亦要鑒別并診斷它們，并確立治療方針。又，抗性因子的存在亦可用于投藥的選定判斷等。

另一方面，在單獨(dú)的測(cè)定項(xiàng)目當(dāng)中，作為確認(rèn)該測(cè)定是否真的順利進(jìn)行的手段，設(shè)定內(nèi)部控制(internal control)亦是有用的。此是預(yù)先準(zhǔn)備用以擴(kuò)增之與檢測(cè)目標(biāo)的標(biāo)的基因無關(guān)系的核酸序列，且不論標(biāo)的基因的有無，是可確認(rèn)反應(yīng)是否順利進(jìn)行。藉此，可在測(cè)定之中確認(rèn)測(cè)定試劑或裝置是否有效作用。

如此，在檢測(cè)復(fù)數(shù)個(gè)標(biāo)的核酸時(shí)，可認(rèn)為是有實(shí)施各別的測(cè)定，或者，對(duì)檢測(cè)的各個(gè)標(biāo)的核酸使用不同的標(biāo)記色素等來識(shí)別的手段。

或者，亦可在同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)后，緩慢的使溫度上升(或下降)，并從顯示出熒光訊號(hào)的變化率的波鋒的溫度與標(biāo)的核酸的熔解溫度來識(shí)別判斷(熱熔解曲線分析法)。

然而，各別測(cè)定會(huì)花費(fèi)時(shí)間或成本，識(shí)別不同的標(biāo)記物亦不僅要準(zhǔn)備復(fù)數(shù)個(gè)標(biāo)記試劑，分析裝置的波長設(shè)定等亦會(huì)花費(fèi)成本。

使用熱熔解曲線分析法時(shí)，成本雖低，然需要緩慢的使溫度變化，因此為了進(jìn)行正確的分析，不得不花費(fèi)5～10分鐘左右的時(shí)間來進(jìn)行溫度變化。

在專利文獻(xiàn)1(日本特開2002-136300號(hào)公報(bào))，是準(zhǔn)備置入有不同反應(yīng)液的復(fù)數(shù)個(gè)反應(yīng)容器，并分別進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。具有在每一項(xiàng)目要調(diào)制試劑、分注作業(yè)而麻煩的問題點(diǎn)。

在專利文獻(xiàn)2(日本特開2004-203號(hào)公報(bào))，是在置入有1種反應(yīng)液的1個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增復(fù)數(shù)個(gè)基因。其是透過先改變標(biāo)記色素來識(shí)別每個(gè)基因。由于光是使用的標(biāo)記色素的數(shù)量，檢測(cè)裝置的光學(xué)系統(tǒng)便需要復(fù)數(shù)個(gè)，因此具有裝置成本變高的問題點(diǎn)。

在專利文獻(xiàn)3(日本特開2008-173127號(hào)公報(bào))，是在置入有1種反應(yīng)液的1個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增復(fù)數(shù)個(gè)基因。在每一項(xiàng)目改變PCR產(chǎn)物或標(biāo)記探針的解離溫度，且在擴(kuò)增后，使溫度從低溫側(cè)慢慢上升至高溫側(cè)并監(jiān)測(cè)熒光值以進(jìn)行解離曲線分析(與「熱熔解曲線分析」同義。)，再透過監(jiān)測(cè)在取決于堿基序列的各個(gè)解離溫度下是否有波鋒來識(shí)別。

若提升熔解曲線分析時(shí)溫度變化的速度，則識(shí)別各項(xiàng)目的熔解溫度會(huì)變困難，因此會(huì)有在PCR反應(yīng)后還要額外花費(fèi)5～10分鐘左右的時(shí)間的問題點(diǎn)。

在專利文獻(xiàn)4(日本特表2012-513215號(hào)公報(bào))，是在1個(gè)反應(yīng)液容器中同時(shí)擴(kuò)增復(fù)數(shù)個(gè)基因。針對(duì)每一個(gè)基因改變PCR產(chǎn)物的解離溫度與引物的熔解溫度，并在各自的熔解溫度下監(jiān)測(cè)熒光并識(shí)別。

通常的PCR程序(PCR profile)在1循環(huán)中，設(shè)置有變性、退火、延長步驟，然在專利文獻(xiàn)4是在每一項(xiàng)目改變PCR產(chǎn)物的熔解溫度，因此需要考慮的條件多，程序的設(shè)計(jì)困難，且測(cè)定時(shí)間亦變長。由于溫度變化激烈，有裝置的負(fù)擔(dān)亦大的問題點(diǎn)。