[發明專利]用于懸浮細胞的小規模養殖方法

在審

• 申請號: 201680030077.0
• 申請日: 2016-05-25
• 公開（公告）號: CN108138128A
• 公開（公告）日: 2018-06-08
• 發明（設計）人: S·戈勒茲;R·施塔恩;S·克雷耶
• 申請（專利權）人: 葛萊高托普有限公司
• 主分類號: C12N5/02
• 分類號: C12N5/02
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 袁泉

本發明屬于細胞養殖領域。提供了小規模細胞培養系統，其模擬了懸浮細胞的大規模灌注培養物。具體而言，本發明提供了養殖細胞的方法，其中細胞沉淀用于將細胞與培養介質分離，以替換部分培養介質。

技術領域

本發明涉及小規模細胞培養系統，其模擬了懸浮細胞的大規模灌注培養物。本發明特別提供了用于養殖細胞的方法，其中使用細胞沉淀從培養介質分離細胞，用于替換部分培養介質。該方法可以用于模擬大規模細胞培養，并用于篩選培養條件和用于大規模細胞培養的細胞克隆。

背景技術

重組蛋白質的生產是目前生物技術工業的主要方面。隨著市場上需要大量高品質蛋白質的應用數量的增加，重組蛋白質的生產越來越重要。食品生產，特別是藥物學是其中對重組蛋白質的需要穩定增加的2個主要領域。獲得市售可得的工藝需要更高的生產效率及終產物的更低成本。

但是，高的產品品質和與人類應用的相容性是同時必需的。越來越多的應用需要在真核細胞中，特別是在更高級的真核細胞中重組生產蛋白質。特別是當在原核細胞系統(例如大腸桿菌(E.coli))或真核細胞系統(例如特別是人細胞系)中表達攜帶翻譯后修飾(例如糖基化)的蛋白質(糖蛋白)時。在許多情況下，這些差異明顯地影響了所生產的蛋白質的生物活性以及免疫原性。然而，許多使用更高級的真核細胞系的表達系統都受困于所需蛋白質的相當低的表達率，導致重組蛋白質的低產率和高成本。

為了改善在真核細胞中生產重組蛋白質的產率和品質(包括它們翻譯后修飾的特征)，優化了多種培養條件，并測試了大量的細胞克隆。在大規模細胞培養物中操作這種篩選工藝是非常昂貴的并且是繁瑣的，其中所述大規模細胞培養物用于重組蛋白質的后期生產。因此，此類篩選工藝通常以小規模培養物實施。但是，這種小規模培養物通常在它們的行為上與它們將要模擬的大規模培養物明顯不同。當轉變成大規模時，在小規模培養中建立的培養條件和細胞克隆證明不是最佳的。

可信賴的按比例縮小的模式對于高效快速的生物工藝研發是重要的。重要的操作(例如介質或工藝的優化和克隆篩選)通常不是在工藝條件下實施的，這是因為諸如操作的高成本或低生產量之類的多種原因。生物處理的主要任務是發現合適的按規模縮小的模型，其盡可能最佳地代表了更大的規模。可利用的按規?？s小的系統必須主要地使重要參數與大規模以及介質與高生產量達到令人滿意的可比性。

先進的微生物反應器(ambr)系統代表了這種按規?？s小的工具，其具有優于更大規模的生物反應器的再現性(Hsu et al.(2012)Cytotechnology 64:667-678)。ambr系統由工作體積為10至15ml的一次性容器、液體處理機器人以及測量氧飽和度(DO)和在線pH的監測儀組成。生產量限于24或48個容器，這取決于裝置設備。ambr系統廣泛地用作分批和分批供料養殖的按規?？s小的模型。但是，灌注培養是不可行的。1L臺式生物反應器被認為是用于灌注培養的最小的按規?？s小單位(Shimoni et al.(2014)BioProcess Int 12:54-61)。研發更小規模的灌注系統的障礙是細胞保持裝置的按規?？s小。典型的細胞保持裝置在Voisard et al.(2003)Biotechol Bioeng 82:751-765中有所討論，并且基于過濾或離心的機制需要過多的死體積，以至于小體積的生物反應器不能高效地工作。在灌注細胞培養開始時，研究沉淀作為細胞分離方法，并且進一步的研發得到外部裝置，例如傾斜沉降器。盡管是強力的并且產生小的剪切應力，但是細胞殘留在生物反應器的外部，面對不所需的條件，例如更低的溫度或不足的氧供應(Voisard et al.(2003)Biotechol Bioeng 82:751-765)。

因此，本領域需要提供以小規模高效地模擬大規模細胞培養的方法，用于篩選目的，特別是在使用真核表達細胞系時。

發明概述