[發明專利]用于治療神經退行性疾病的干細胞衍生多巴胺能細胞的生產方法和組合物

有效

• 申請號: 201680020846.9
• 申請日: 2016-04-08
• 公開（公告）號: CN107438669B
• 公開（公告）日: 2022-09-27
• 發明（設計）人: 阿格尼特·柯克比;馬林·佩爾尼萊·帕馬
• 申請（專利權）人: 拜奧拉米那公司
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797;C12N5/0735;A61K35/30;A61P25/16;A61P25/28
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李唐

本發明涉及生產多巴胺能細胞和評價其功能的方法。在包被有層粘連蛋白?111、層粘連蛋白?121、層粘連蛋白?521、層粘連蛋白?421或層粘連蛋白?511的培養板上，使用含有GSK3抑制劑和TGF?β抑制劑并適時施加成纖維細胞生長因子的培養基來培養多能人胚胎干細胞，此時所需神經細胞以更高的速率產生。本發明還描述了用于生產這種多巴胺能細胞的有用的細胞培養試劑盒，以及使用這種細胞進行干細胞治療的方法。

相關的申請的交叉引用

本申請要求于2015年2月25日遞交的美國臨時專利申請號 62/300,000、2015年6月19日遞交的美國臨時專利申請號62/182,051 以及2015年4月9日遞交的美國臨時專利申請號62/145,467的優先 權，通過引用將前述申請的全部公開內容并入本文。

背景技術

通過引用將文件名為“Seq_List_LCTI_200040USP3_ST25.txt” 的ASCII文本文件中的材料并入本申請，該文件創建于2006年2月 10日，文件大小為8,781字節。

本發明涉及由人類多能干細胞(hESCs)生產某些所需的多巴胺 能細胞的方法，以及基于分子標志物預測其移植至腦部后的表型成熟 的方法。這些多巴胺能細胞可用于基于干細胞的治療，例如治療包括 帕金森病在內的神經退行性疾病。本發明還公開了用于實施該方法的 試劑盒。通常，在層粘連蛋白-111(或其他重組生產的層粘連蛋白) 的基底上培養干細胞，并將這些干細胞暴露于多種細胞培養基中，以 便比此前方法更高效地獲得多巴胺能細胞。

層粘連蛋白是主要存在于基膜的異三聚體糖蛋白家族。它們通 過與一側相鄰細胞受體結合相互作用，以及與其他層粘連蛋白分子或 其他基質蛋白(例如膠原、巢蛋白或蛋白聚糖)結合來起作用。層粘 連蛋白分子也是重要的信號轉導分子，可以強烈影響細胞的行為和功 能。層粘連蛋白在維持細胞/組織表型方面，以及在組織修復和發育 中促進細胞生長和分化方面都很重要。

層粘連蛋白是一類多結構域的大蛋白，具有共同的結構組織。 層粘連蛋白分子包括一個α鏈亞基、一個β鏈亞基和一個γ鏈亞基， 它們通過一個卷曲螺旋結構域連接形成三聚體。在天然組織中，十二 種已知的層粘連蛋白亞基鏈可以形成至少15種類型的三聚體層粘連 蛋白。在三聚體層粘連蛋白結構內具有與其他層粘連蛋白和基膜分子 結合活性的可識別結構域以及膜結合受體。圖1分別示出了三種層粘 連蛋白鏈亞基。例如，結構域VI、IVb和IVa形成球狀結構，而結 構域V、IIIb和IlIa(其含有富含半胱氨酸的EGF樣元件)形成棒狀 結構。三條鏈中的I和II結構域參與形成三股鉸鏈卷曲螺旋結構(長 臂)。

在人組織中存在五種不同α鏈、三種β鏈和三種γ鏈，已經發 現了至少十五種它們的不同組合。基于它們的歷史發現順序，這些分 子被命名為層粘連蛋白-1至層粘連蛋白-15，而另一種命名法依據其 鏈的組成描述了其異構體，例如包含α-1、β-1和γ-1鏈的層粘連蛋白 -111(層粘連蛋白-1)。已經確定出四個由結構定義的層粘連蛋白家 族組。五個已確定的層粘連蛋白分子構成第一組，它們的β1和γ1 鏈相同，而α鏈組成不同(α1至α5鏈)。包括層粘連蛋白-521在內 的五個已確定的層粘連蛋白分子構成第二組，它們的β1和γ1鏈相同， 而α鏈組成不同。已確定的層粘連蛋白分子的第三組只有一個已確定 的成員，層粘連蛋白-332，其鏈組成為α3β3γ2。已確定的層粘連蛋 白分子的第四組只有一個已確定的成員，層粘連蛋白-213，其具有新 識別出的γ3鏈(α2β1γ3)。

人類胚胎干細胞(hES)為多種疾病的再生醫學發展提供了希望， 所述疾病如脊髓和心臟損傷、I型糖尿病和諸如帕金森病之類的神經 退行性疾病等。干細胞是一種未分化的細胞，其可分化成為特化的細 胞。胚胎干細胞具有廣泛的自我更新能力和多能性，具有分化成所有 三種胚層的細胞的潛力，其可用于治療目的，并且可以為組織替代療 法、藥物篩選、功能基因組學和蛋白質組學提供無限的細胞來源。