[發(fā)明專利]用于治療神經(jīng)退行性疾病的干細(xì)胞衍生多巴胺能細(xì)胞的生產(chǎn)方法和組合物

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201680020846.9
• 申請(qǐng)日: 2016-04-08
• 公開（公告）號(hào): CN107438669B
• 公開（公告）日: 2022-09-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 阿格尼特·柯克比;馬林·佩爾尼萊·帕馬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 拜奧拉米那公司
• 主分類號(hào): C12N5/0797
• 分類號(hào): C12N5/0797;C12N5/0735;A61K35/30;A61P25/16;A61P25/28
• 代理公司: 中國(guó)專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 李唐

1.一種誘導(dǎo)產(chǎn)生尾部腹側(cè)中腦祖細(xì)胞的方法，其包括：

將胚胎干細(xì)胞鋪板接種于含有層粘連蛋白-111、層粘連蛋白-421、層粘連蛋白-511或?qū)诱尺B蛋白-521的基底上，以產(chǎn)生尾部腹側(cè)中腦祖細(xì)胞，

其中所述干細(xì)胞在含有N2培養(yǎng)基、TGF-β抑制劑、頭蛋白、聲猬蛋白和GSK3抑制劑并且不含B27補(bǔ)充劑的初級(jí)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，其中所述TGF-β抑制劑以5μM至15μM的濃度存在，所述頭蛋白以50 ng/ml至150 ng/ml的量存在，所述GSK3抑制劑以0.2μM或更高的濃度存在，所述聲猬蛋白以至少50 ng/ml的量存在，

其中去除所述初級(jí)培養(yǎng)基并加入二級(jí)培養(yǎng)基，所述二級(jí)培養(yǎng)基含有N2培養(yǎng)基和以50ng/ml至150 ng/ml的量的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8b（FGF8b），且不含B27補(bǔ)充劑，

其中所述二級(jí)培養(yǎng)基在鋪板接種后156小時(shí)至228小時(shí)內(nèi)加入，

其中除去所述二級(jí)培養(yǎng)基，并重新鋪板接種干細(xì)胞，

其中所述重新鋪板接種在鋪板接種后252小時(shí)至276小時(shí)內(nèi)進(jìn)行，

其中所述重新鋪板接種使用含有B27培養(yǎng)基、ROCK抑制劑、FGF8b、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）和抗壞血酸的三級(jí)培養(yǎng)基進(jìn)行，其中所述ROCK抑制劑以5μM至15μM的濃度存在，所述FGF8b以50 ng/ml至150 ng/ml的量存在，所述BDNF以5 ng/ml至30 ng/ml的量存在，和所述抗壞血酸以0.1 mM至0.5 mM的濃度存在，和

其中所述干細(xì)胞隨后在四級(jí)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述四級(jí)培養(yǎng)基含有B27培養(yǎng)基、FGF8b、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）和抗壞血酸，其中所述FGF8b以50 ng/ml至150 ng/ml的量存在，所述BDNF以5 ng/ml至30 ng/ml的量存在，和所述抗壞血酸以0.1 mM至0.5 mM的濃度存在。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述干細(xì)胞在四級(jí)培養(yǎng)基中培養(yǎng)直至鋪板接種后324小時(shí)至396小時(shí)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述干細(xì)胞在四級(jí)培養(yǎng)基中培養(yǎng)持續(xù)108小時(shí)至132小時(shí)的時(shí)間段。