[發明專利]在液相中的連接測定

在審

• 申請號: 201680018676.0
• 申請日: 2016-01-26
• 公開（公告）號: CN108112258A
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發明（設計）人: 安東尼·史蒂文斯;布魯斯·塞利希曼;喬安妮·M·耶克利;喬爾·麥庫姆
• 申請（專利權）人: 生物蜘蛛技術有限公司
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;C12Q1/68
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 張英;沈敬亭

1.一種用于在樣品中檢測靶核酸序列的方法，其中靶序列具有下游區(DR)和上游區(UR)，所述方法包括

(a)使所述樣品接觸

具有互補下游區(DR’)的下游檢測器寡核苷酸(DD)以及

具有互補上游區(UR’)的上游檢測器寡核苷酸(UD)，

從而允許所述檢測器特異性地雜交于所述靶核酸；

(bl)如果所述DR’和UR’的兩者均特異性地雜交于靶序列的所述DR和UR，則連接所述DR’和UR’；以及

(b2)將雜交復合物暴露于至少一種降解單鏈但不顯著降解雙鏈的核酸酶，其中所述DD或UD的至少一種配置為抵抗所述核酸酶，

從而，通過所述核酸酶來降解非特異性地雜交的DD和UD；

從而，連接產物指示在所述樣品中存在所述靶序列。

2.根據權利要求1所述的方法，其中在液相中進行步驟(a)、步驟(b1)、或兩者；或其中在所述靶核酸附接至固體表面時，進行步驟(a)或步驟(b1)。

3.根據權利要求1所述的方法，其中通過將試劑加入和前述步驟相同的反應容器來進行步驟(a)、(b1)、或(b2)的至少一個。

4.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是微小RNA或其部分，其中可選地在步驟(a)之前所述微小RNA是3’-多腺苷酸化的并且所述DD具有鄰近所述DR’的聚T區。

5.根據權利要求1所述的方法，其中，所述核酸酶具有3’-至-5’活性；或具有5’-至-3’活性；或消化5’活瓣。

6.根據權利要求1所述的方法，其中，所述方法進一步包括以下任意項

(c)滅活所述核酸酶；

(d)擴增所述連接產物；或

其中通過至少一種核苷酸分離所述DR和UR，

(b0)使用所述樣品作為模板來延伸所述DR’。

7.根據權利要求1所述的方法，其中，通過具有第二互補區(DR2’或UR2’)配置所述下游檢測器(DD)或所述上游檢測器(UD)的至少一個，從而所述DR2’或UR2’可以特異性地雜交至所述靶序列的DR2或UR2。

8.根據權利要求7所述的方法，其中，所述DD具有在所述DR’的下游的第一擴增區(P1)，并且所述UD具有在所述UR’的上游的第二擴增區(Ρ2’)。

9.根據權利要求7所述的方法，其中，在步驟(a)中提供用于高豐度靶序列(HAT)的具有DR2、DR2’、UR2、或UR2’的一部分的衰減子寡核苷酸。

10.根據權利要求9所述的方法，其中，所述衰減子(i)具有DR2的一部分和DR的一部分或(ii)具有UR的一部分和UR2的一部分。

11.根據權利要求1所述的方法，其中，(i)通過5’-外切核酸酶阻斷基團配置所述DD，(ii)通過3’-外切核酸酶阻斷基團配置所述UD，

或(i)和(ii)的兩者。

12.根據權利要求11所述的方法，其中，所述阻斷基團是固相。

13.根據權利要求1所述的方法，其中，通過具有雜交于DR2保護器寡核苷酸的5’-端DR2’區配置DD；或其中，通過具有雜交于UR2保護器寡核苷酸的3’-端UR2’序列配置UD。

14.根據權利要求1所述的方法，其中，當雜交至所述靶序列時，通過形成環化結構配置至少一種檢測器寡核苷酸。

15.一種用于進行權利要求1所述的方法的試劑盒，包含用于靶序列和至少一種核酸酶的檢測器；可選地進一步包含連接酶；或可選地進一步包含用于在所述試劑盒中的酶的反應緩沖劑的成分，其中所述成分適合添加用于在和所述方法的前述步驟相同容器中的酶反應。