[發明專利]在液相中的連接測定

在審

• 申請號: 201680018676.0
• 申請日: 2016-01-26
• 公開（公告）號: CN108112258A
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發明（設計）人: 安東尼·史蒂文斯;布魯斯·塞利希曼;喬安妮·M·耶克利;喬爾·麥庫姆
• 申請（專利權）人: 生物蜘蛛技術有限公司
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;C12Q1/68
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 張英;沈敬亭

用于檢測核酸序列的在液相中的連接測定。

與相關申請的引用

本申請要求2015年1月27日提交的美國臨時申請系列62/108,161和2015年6月30日提交的美國申請系列14/788,670的優先權的利益，上述兩者的全部內容并入本文。

政府支持聲明

在授權號為1R43HG007815的政府支持下作出本發明，由國立衛生研究院(National Institutes of Health)授予。政府對本發明有一定的權利。

技術領域

本發明涉及分子生物學，以及更具體地涉及用于檢測在樣品中的核酸序列的測定。

發明內容

本發明提供了用于在樣品中檢測感興趣的核酸序列的靶序列的方法，以及還提供了用于進行上述方法的試劑盒。

在典型的連接測定中，使樣品接觸一組檢測器寡核苷酸(a pool of detectoroligos)，其中為每個靶序列提供下游檢測器(DD)和上游檢測器(UD)。DD的部分(DR’)與指定為下游區(DR)的靶序列的區互補。上游檢測器具有互補與靶序列的上游區(UR)的部分(UR’)。

使下游和上游檢測器接觸樣品并允許雜交于在樣品中存在的靶序列的相應區。當檢測器特異性地雜交于靶序列時，可以在相鄰檢測器之間的接合點處連接它們，無論直接或在可選的延伸步驟以后。因而，連接產物的形成證明在樣品中存在靶序列，以及可以通過各種方法來檢測連接產物，如可檢測標記、微陣列、qPCR、流通計數器、和測序。

本發明提供了測定，其中在方法的步驟期間提供一種或多種核酸酶，以選擇性地降解未使用或過量的檢測器、或沒有特異性地雜交于靶序列的檢測器。因此，在許多實施方式中，測定的檢測器和其它成分成配置為在檢測靶序列的同時抵抗核酸酶。該配置使得能夠在全轉錄體或全miRNome復用下以及在單個細胞的水平下敏感檢測核酸，如mRNA和miRNA。此外，可以在單孔或容器中進行上述步驟，而無需轉移、分離、或固相固定，因而可理想用于微流控平臺。

附圖說明

圖1示出了用于檢測靶核酸序列的代表性連接測定。簡要地，允許下游檢測器(DD)和上游檢測器(UD)探針寡核苷酸(a)雜交于在樣品中的具有DR和UR區的靶序列。為了方便識別，在本文中經常下劃線上游區。在雜交于靶序列的DR和UR的同時，將DD(b2)選擇性地連接于UR。可選地，在(b2)連接之前，(b0)延伸DD。通過擴增區P1和P2’，并借助于一種或多種引物，如P1和P2，來可選地(c)擴增連接產物。

圖2a示出了本發明的“錨定”測定設計，其中UD配置有通過非互補區(CP1)分隔開的第二互補區(UR2’或“錨形物”)。如在2b圖中，DD和UD可以雜交于靶序列，從而形成雜交復合物(HC)，提供用于在DR’和UR’之間的接合(L)處的連接的底物。在連接以后，圖2c示出了可以通過引物來擴增連接產物(LP)以產生在圖2d中的擴增產物(AP)。

在方法的各個階段，可以使用借助于外切核酸酶進行的治療，如具有單鏈3’-至-5’活性的外切核酸酶，以除去不希望的成分，如未結合或過量的DD和UD檢測器，如在2e圖中。非特異性地或不完全雜交于靶序列的檢測器可以通過外切核酸酶加以降解或將不會導致連接或擴增產物，如在圖2f中。

如圖2g所示，可能期望提供預定量的衰減子寡核苷酸如UR2’(或可替代地UR2)以減少來自某些高豐度靶序列(HAT)的產物的形成。

圖2h示出了一對檢測器，其成配置為在一端具有修飾，從而抵抗降解單鏈(ss)DNA的外切核酸酶。UD具有在3’端處的修飾，其抵抗通過在DNA單鏈上具有的3’活性的外切核酸酶的檢測器的降解。可替換地，DD可以具有5’修飾以抵抗由5’-ss-外切核酸酶的降解。