[發明專利]凝血酶?抗凝血酶復合體的測定試劑及測定方法

在審

• 申請號: 201680017680.5
• 申請日: 2016-03-29
• 公開（公告）號: CN107533050A
• 公開（公告）日: 2018-01-02
• 發明（設計）人: 吉田竜也;楊宇航
• 申請（專利權）人: 美迪恩斯生命科技株式會社
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/543
• 代理公司: 北京信慧永光知識產權代理有限責任公司11290
• 代理人: 王玉玲,李雪春

技術領域

本發明涉及對活體試樣中的凝血酶(T)-抗凝血酶(AT)復合體(TAT)進行測定的試劑及方法。

背景技術

凝血酶-抗凝血酶復合體(TAT)是在血液凝固時產生在血液中的蛋白復合體，血液中的TAT的定量對于彌漫性血管內凝血(DIC)等血栓形成的診斷有用。然而，TAT的存在量是游離抗凝血酶的存在量的約十萬分之一，因此不容易測定。

現在主流的TAT定量法包括西門子公司的Enzygnost(注冊商標)TAT micro等使用酶免疫測定法(ELISA)的試劑盒及LSI MEDIENCE公司的STACIA(注冊商標)CLEIA TAT等使用化學發光酶免疫測定法(CLEIA)的試劑盒，但均是需要固相-液相分離(B/F分離)的測定法，需要煩雜的清洗作業，需要手動作業或專用設備。

專利文獻1～3及5中報道了在使用膠乳凝聚法的TAT測定中所用的試劑體系，但均是通過將體外合成的TAT用緩沖液進行稀釋而制作的樣品的測定，并未報道出能夠使用膠乳凝聚法對人檢體中的TAT準確地進行濃度測定的試劑。另外，這些文獻記載的方法均是依存于抗體的特異性來構建TAT測定試劑或利用添加劑來避免由該交叉反應性帶來的影響。專利文獻4公開了通過使用不具有交叉反應性的抗體的夾心(sandwich)法進行的TAT測定，但是并不具有對于在臨床上利用而言充分的靈敏度。另外，在任一文獻中均未就定量實際檢體中的TAT時對測定反應時的pH的測定結果的影響進行研究，迄今為止并沒有在利用膠乳免疫凝聚法測定TAT時以酸性側的pH進行反應的實例。

基于以上情況，在測定簡便的膠乳凝聚法中需要高靈敏度、高精度地測定活體試樣中的TAT的試劑及方法。

現有技術文獻

專利文獻

專利文獻1：日本特開2001－289850號公報

專利文獻2：日本特開平7－238099號公報

專利文獻3：日本特開2002－316999號公報

專利文獻4：日本特開平3－48158號公報

專利文獻5：日本特開2001－228153號公報

發明內容

發明要解決的課題

本發明的課題在于提供使用不必須進行B/F分離或清洗作業的膠乳凝聚法的活體試樣中的TAT的測定試劑及測定方法、以及提供高效選擇其所使用的抗體的方法。

關于TAT的測定，從提高DIC診斷基準的靈敏度、特異度的觀點出發，并且從用于在TAT測定值為正常時DIC為否定的排除診斷的使用可能性的觀點出發，確認了其臨床上的有用性。但是，現在需要煩雜手藝的ELISA法和需要專用設備的CLEIA法成為主流，這也是測定普及慢的原因。

因此，在測定簡便的膠乳凝聚法中需要高靈敏度、高精度地測定活體試樣中的TAT的試劑及方法。

另外，在考慮其臨床意義的情況下，需要與CLEIA法同等的能夠以數納克單位進行測定的檢測靈敏度，但從所使用的粒子的特性等其測定原理考慮，利用膠乳凝聚法達成與CLEIA法同等的靈敏度是非常困難的課題。

另外，像ELISA法、CLEIA法等那樣，膠乳凝聚法不包括利用清洗等的B/F分離的工序，因此克服與除游離抗凝血酶等作為本來目標的測定對象物質以外的交叉反應性是構建試劑、測定法時的課題。

用于解決課題的手段

本發明人為了解決上述課題而進行了深入研究。其結果發現：在使用膠乳凝聚法的活體試樣中的TAT的測定法中，通過使用具有交叉反應性的抗體，并利用該交叉反應性之差，從而可以制作高靈敏度且高精度的TAT測定試劑。即發現：通過使用通過間接抑制ELISA法選擇的對TAT的反應性與對游離抗凝血酶的反應性之差為100倍以上的抗體作為抗體之一，從而可以將游離抗凝血酶的影響抑制成最小限而準確地測定活體試樣中的TAT。進而發現：在使用膠乳免疫凝聚法的活體試樣中的TAT的測定法中，通過在弱酸性的條件下進行凝聚反應，從而可以高靈敏度且特異性地測定活體試樣中的TAT，以至完成本發明。

即，本發明提供以下方案。

[1]一種凝血酶-抗凝血酶復合體(TAT)測定試劑，其特征在于，其包含結合在膠乳粒子上的且與抗凝血酶側結合來識別TAT的抗體和結合在膠乳粒子上的且與凝血酶側結合來識別TAT的抗體，

上述與抗凝血酶側結合來識別TAT的抗體對TAT的反應性為對游離抗凝血酶的反應性的100倍以上。

[2]根據[1]所述的TAT測定試劑，其特征在于，其以使測定時的pH達到5.8～6.6的方式來構成。