[發(fā)明專(zhuān)利]用于增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)肉毒神經(jīng)毒素的特異性攝取的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201680013526.0
• 申請(qǐng)日: 2016-03-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108064310B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-06-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 克勞迪婭·姚茨科;卡爾-海因茨·艾澤勒;格爾德·曼德;克勞斯·芬克
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 莫茨藥物股份兩合公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/02
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/02
• 代理公司: 北京柏杉松知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11413
• 代理人: 王春偉;劉繼富

1.一種用于直接測(cè)定細(xì)胞中神經(jīng)毒素多肽的生物活性的體外方法，包括：

a) 在允許神經(jīng)毒素多肽發(fā)揮其生物活性的條件下，將對(duì)神經(jīng)毒素中毒敏感的細(xì)胞與所述神經(jīng)毒素多肽一起孵育一段時(shí)間，其中所述神經(jīng)毒素多肽為肉毒神經(jīng)毒素BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G或BoNT/H，并且其中所述孵育包括：(i) K⁺介導(dǎo)的細(xì)胞去極化，其中K⁺介導(dǎo)的細(xì)胞去極化在最終K⁺濃度為15mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM或60mM下進(jìn)行至少30分鐘，并且減少神經(jīng)毒素多肽的暴露時(shí)間為至少24小時(shí)且小于96小時(shí)，或者(ii)減少神經(jīng)毒素多肽的暴露時(shí)間為至少24小時(shí)且小于96小時(shí)并且在神經(jīng)毒素多肽暴露期間攪動(dòng)所述細(xì)胞；

b) 固定所述細(xì)胞，并且任選地用洗滌劑透化所述細(xì)胞；

c) 使所述細(xì)胞與至少一種特異性結(jié)合未裂解底物和神經(jīng)毒素裂解底物的第一捕獲抗體和至少一種特異性結(jié)合神經(jīng)毒素裂解底物的裂解位點(diǎn)的第二捕獲抗體在允許所述捕獲抗體與所述底物結(jié)合的條件下接觸；

d) 使所述細(xì)胞與至少一種特異性結(jié)合所述第一捕獲抗體的第一檢測(cè)抗體在允許所述第一檢測(cè)抗體與所述第一捕獲抗體結(jié)合的條件下接觸，從而形成第一檢測(cè)復(fù)合物，并且使所述細(xì)胞與至少一種特異性結(jié)合所述第二捕獲抗體的第二檢測(cè)抗體在允許所述第二檢測(cè)抗體與所述第二捕獲抗體結(jié)合的條件下接觸，從而形成第二檢測(cè)復(fù)合物；

e) 測(cè)定步驟d)中的第一檢測(cè)復(fù)合物和第二檢測(cè)復(fù)合物的量；以及

f) 同時(shí)測(cè)定總的神經(jīng)毒素底物的量和被所述神經(jīng)毒素多肽裂解的底物的量，從而測(cè)定所述細(xì)胞中所述神經(jīng)毒素多肽的生物活性。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述神經(jīng)毒素多肽的暴露在存在神經(jīng)節(jié)苷脂GT1b的情況下進(jìn)行。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中GT1b以介于15和50μM之間的濃度使用。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中GT1b以20μM的濃度使用。

5.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述減少神經(jīng)毒素多肽的暴露時(shí)間為使所述細(xì)胞暴露于所述神經(jīng)毒素多肽至少48小時(shí)且最多72小時(shí)。

6.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的方法，其中在神經(jīng)毒素多肽暴露期間攪動(dòng)所述細(xì)胞以磁力攪拌器、旋轉(zhuǎn)瓶或者通過(guò)搖動(dòng)器搖動(dòng)細(xì)胞進(jìn)行。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中在神經(jīng)毒素多肽暴露期間攪動(dòng)所述細(xì)胞在25cm/min至300cm/min的平均培養(yǎng)基流率下進(jìn)行。

8.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的方法，其中沒(méi)有神經(jīng)毒素多肽情況下的孵育先于所述神經(jīng)毒素多肽的暴露。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述沒(méi)有神經(jīng)毒素多肽情況下的孵育的時(shí)間介于16和48小時(shí)之間。

10.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法為熒光方法。

11.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述底物為VAMP/小突觸泡蛋白、SNAP-25或突觸融合蛋白。

12.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞為選自下列的神經(jīng)元細(xì)胞或神經(jīng)元分化細(xì)胞：原代神經(jīng)元細(xì)胞；能夠分化成神經(jīng)元細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞；P19細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(IPS)衍生的神經(jīng)元。

13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述能夠分化成神經(jīng)元細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞為成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞。