[發(fā)明專利]生產(chǎn)酵母突變體的方法及其用途

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201680009586.5
• 申請(qǐng)日: 2016-02-04
• 公開（公告）號(hào): CN107820517A
• 公開（公告）日: 2018-03-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: J·弗洛里奇;J·埃克;G·穆勒;C·諾摩爾;J·布什切爾;J·邁姆佩爾
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 德國愛普斯樂集團(tuán);布萊恩股份公司
• 主分類號(hào): C12N15/01
• 分類號(hào): C12N15/01;C12N1/19;C12G1/022;C12R1/865
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司31100
• 代理人: 陳揚(yáng)揚(yáng),陶家蓉

本申請(qǐng)涉及生產(chǎn)酵母突變體的方法，其間至少一個(gè)酵母株在第一誘變步驟中與第一誘變劑接觸并且在第二誘變步驟中與第二誘變劑接觸，以及通過該方法產(chǎn)生的酵母和這類酵母的用途。

近年來，許多葡萄種植區(qū)在釀酒葡萄成熟期的氣溫急劇上升，其也增加了通過這種方式成熟的葡萄的糖含量。在用于生產(chǎn)葡萄酒的乙醇發(fā)酵的情況下，通過使用酵母株將該糖，特別是葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇作為主要的發(fā)酵產(chǎn)物。近年來，在用于生產(chǎn)葡萄酒的乙醇發(fā)酵的情況下，出現(xiàn)了如下問題：因?yàn)槠咸阎衅咸烟呛吭黾樱a(chǎn)的葡萄酒呈現(xiàn)升高的酒精含量。消費(fèi)者不希望這樣的高酒精含量，即使在不同的年份，消費(fèi)者更喜歡單獨(dú)葡萄酒中的酒精含量盡可能一致。酒精含量較低的葡萄酒的需求量也在近期有所增加。此外，葡萄酒中的乙醇代表著這樣一種成分，其一方面是必需和可取的，但是在含量較高的情況下，可能會(huì)導(dǎo)致葡萄酒的風(fēng)味品質(zhì)受損。高甘油濃度，例如超過10克/升，對(duì)葡萄酒的風(fēng)味特性有積極作用。

提供這些性質(zhì)的嘗試包括使用已知的酵母，其在汁(must)中針對(duì)相同量的糖產(chǎn)生較少乙醇。一些這樣的酵母是已知的；特別是用于生產(chǎn)高品質(zhì)的葡萄酒，然而，希望有一些不同的酵母可供選擇，其產(chǎn)生可顯著影響葡萄酒風(fēng)味特性的其他次生物質(zhì)而不是乙醇。

生產(chǎn)這種酵母的嘗試具體包括有意的遺傳修飾和常規(guī)培育以及基于常規(guī)培育的選擇過程。在WO 2011/080411中公開了產(chǎn)生具有所需性質(zhì)的酵母的這種方法的示例。具體遺傳修飾的生物體的缺點(diǎn)是消費(fèi)者對(duì)這些生物體存在高度懷疑。培育方法和基于常規(guī)培育和純選擇過程的方法也可能是可行的，但是方法耗時(shí)非常長(zhǎng)因此成本非常高?；蛘撸吧湍敢脖环蛛x并測(cè)試所需的性質(zhì)。這種分離描述于EP 2 634 247 B1中。這個(gè)過程成本也是非常高，它的成功是不確定的。

在本文中，本發(fā)明的目的在于制備在乙醇發(fā)酵過程中在給定的糖含量下產(chǎn)生比前述使用的株低的乙醇含量和高的甘油含量的酵母，并且它們可同時(shí)快速獲得。

該目的通過上述類型的方法實(shí)現(xiàn)，其中第一和第二誘變劑彼此不同，并且選自以下組：核苷酸-烷基化劑，核苷酸-脫氨基劑和UV輻射，并且第一選擇步驟在第一和第二誘變步驟之間進(jìn)行，并且在第二誘變步驟之后進(jìn)行第二選擇步驟，由此將從相應(yīng)的前述誘變步驟得到的突變體暴露于選自下組的選擇因素：(a)高滲培養(yǎng)基和(b)醇脫氫酶抑制劑。

已經(jīng)看到，在這種方法中，在其間進(jìn)行兩個(gè)誘變步驟，由此在每個(gè)誘變步驟之后額外進(jìn)行選擇步驟，產(chǎn)生酵母，其在給定糖濃度下的酒精發(fā)酵過程中比所用的初始株一方面提供較低的乙醇含量，另一方面在相同條件下產(chǎn)生較高的甘油濃度。兩者都對(duì)使用這種酵母產(chǎn)生的葡萄酒的味道有積極作用。

本文所用的術(shù)語“酵母”優(yōu)選是指酵母屬的酵母，特別優(yōu)選涉及釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或貝酵母(Saccharomyces bayanus)。這也包括亞種，如釀酒酵母亞種貝酵母。

二倍體酵母株優(yōu)選用作本發(fā)明方法中的第一誘變步驟的前述的株。在進(jìn)行突變的情況下，二倍體不丟失，因此最終產(chǎn)生的酵母突變體也是二倍體。二倍體酵母的優(yōu)點(diǎn)是它們的性質(zhì)保持幾代相對(duì)穩(wěn)定，因此特別適合作為純酵母。然而，這種性質(zhì)會(huì)導(dǎo)致非特異性突變，例如通過輻射或誘變劑觸發(fā)，這似乎沒有意義?，F(xiàn)在驚奇地看到，通過將這種非特異性突變的手段，即核苷酸-烷基化劑，核苷酸脫氨基劑或UV輻射與選擇和重復(fù)突變以及進(jìn)一步選擇相結(jié)合，產(chǎn)生具有所需性質(zhì)的酵母突變體，即，減少乙醇生產(chǎn)和增加甘油生產(chǎn)。

術(shù)語“核苷酸-烷基化劑”描述了在烷基和DNA堿基之間形成共價(jià)鍵的物質(zhì)。這種修飾的堿基可導(dǎo)致堿基錯(cuò)配，從而導(dǎo)致點(diǎn)突變。已知多種引起這種烷基化的物質(zhì)。

術(shù)語“核苷酸-脫氨基劑”描述了從DNA堿基分割氨基的物質(zhì)。這種分割也導(dǎo)致堿基錯(cuò)配，即點(diǎn)突變。已知多種引起這種脫氨基化的物質(zhì)。

這里使用的術(shù)語“UV輻射”是指400nm至100nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的電磁輻射，特別是290nm至100nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的UV-C輻射。280nm至240nm，特別是254nm的波長(zhǎng)范圍是優(yōu)選的。優(yōu)選的輻射強(qiáng)度為1000μJ/cm²至3000μJ/cm²，特別優(yōu)選為2000μJ/cm²。這種輻射對(duì)DNA的影響導(dǎo)致形成嘧啶二聚體，特別是胸腺嘧啶二聚體。這些二聚體影響DNA的三維結(jié)構(gòu)，并在復(fù)制過程中阻斷DNA聚合酶。