[發明專利]用于快速活微生物列舉的光譜強度比(SIR)分析

有效

• 申請號: 201680009125.8
• 申請日: 2016-01-09
• 公開（公告）號: CN107250374B
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發明（設計）人: E·扎哈維
• 申請（專利權）人: 塔康特精確有限公司
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04
• 代理公司: 北京律盟知識產權代理有限責任公司 11287
• 代理人: 路勇

單一染料熒光染色(使用膜締合染料，例如FM 1?43或FM 4?64)以及強度和光譜發射二者的差異的組合可區分活細菌與滅活/死細菌且提供對混合群體中的活細菌的快速且準確檢測。

相關申請的交叉引用

本申請案主張于2015年1月12日提出申請的美國臨時申請案第62/102,506號的權益。

技術領域

本文描述快速測量樣品中的活細菌數的方法。所述方法可用于例如以定量方式驗證在許多工業中豐富的不同消毒程序(例如巴斯德滅菌(pasteurizing)、用氯處理、UV、臭氧)的效率且用于評價消耗用食物或水中的活生物體數。

背景技術

樣品中的細菌水平對例如打算用于人類和動物消耗的食物和水來說極其重要。諸如水和飲料公司、食品業、制藥等許多工業使用多種消毒方法來確保在消毒程序后沒有細菌或最少量細菌存活于食品中。

活微生物的定量通常為基于細菌培養物生長的專門實驗室程序。需要在長培育時間內維持固體和液體培養基上的微生物生長的特定條件，在培育時間結束時確定每單位體積的群落形成單位(CFU)數(例如CFU/ml)。在實驗室中，CFU通常是根據樣品的稀釋次數和體積通過正規化所計數群落的總數來計算。此方法需要實驗室設備、合格人員和可介于一天到一個月之間的長時間段。常用程序是將樣品散布于瓊脂板上，和將其培育數小時或有時數天的時段，且然后對生長于板上的群落數進行計數。對于未生長于固體培養基上的微生物和有時對于厭氧生物體，標準為“最大估計計數”(MEC)。(霍爾姆斯W.(Holms W.)，普通微生物學雜志(J.Gen.Microbiol.)54:255-260(1968)；橋水L.(Bridgewater L.)，美國公共衛生協會(American Public Health Association)、美國給水工程協會(AmericanWater Works Association)和水環境聯合會(Water Environment Federation)，用于檢驗水和廢水的標準方法(Standard Methods for the Examination of Water andWastewater).由柳真W.萊斯(Eugene W.Rice)編輯.第22版.華盛頓(Washington,D.C.):美國公共衛生協會，2012)。此方法利用試管連續稀釋和視覺檢查液體透明度，隨后計算起始微生物濃度。然而，需要培養細菌的方法較為緩慢、昂貴且可受細菌凝集、使生物體生長的培養基的類型以及死細胞和碎片存在的影響。另外，一些細菌在培養物中不生長。

因此，對于許多工業有利的是具有通過在不依賴于基于培養物的分析下區分活細菌與滅活細菌驗證其消毒方案的快速工具。

發明內容

本發明方法利用單一染料熒光染色和分析來產生用于快速檢測活細菌的新穎工具。在本發明方法中，組合強度和光譜發射二者的差異以區分活細菌與滅活細菌。

在一實施例中，本申請案提供用于區別經處理樣品中的活細菌與滅活細菌的方法，其包括：用單一膜締合染料對樣品進行染色；用λ激發下的入射光照射樣品；測量每一細菌細胞的(i)波長λ1下發射光的強度I1；和(ii)波長λ2下發射光的強度I2；計算比率I2/I1；和基于所計算I2/I1大于還是小于預定閾值，確定細菌細胞為活的還是滅活的。在另一實施例中，可對于整個樣品而非對于每一細胞個別地實施此相同過程，以測量整個樣品強度。

在一些實施例中，可使用熒光分析、流式細胞術和顯微術。其它實施例(例如但不限于涉及流式細胞術和顯微術的那些)采用單一細菌檢測和定量。

欲分析的測試樣品可為液體、半液體或干燥樣品。在一實施例中，樣品可從飲用水、食品或飲料獲得。在不同實施例中，樣品是從醫藥產品、個人護理產品或體液獲得。體液可包含(但不限于)血漿、唾液、尿、咽喉樣品或胃腸液。在另一實施例中，樣品是從市政水系統、井、可飲水、廢水、天然水源、改水或土壤獲得。在不同實施例中，測試樣品來自醫療裝置。優選地，醫療裝置是植入物、貼片或瓣膜。