[發明專利]核酸分子的構建方法

有效

• 申請號: 201680008496.4
• 申請日: 2016-02-26
• 公開（公告）號: CN107208162B
• 公開（公告）日: 2020-12-29
• 發明（設計）人: 藤岡滿
• 申請（專利權）人: 株式會社日立高新技術
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12N15/09
• 代理公司: 北京銀龍知識產權代理有限公司 11243
• 代理人: 金鮮英;宋海花

1.一種單鏈核酸分子的構建方法，所述單鏈核酸分子用于利用納米孔測序儀進行的核酸序列確定，所述單鏈核酸分子的構建方法包括：

使用3’側含有單鏈區域的至少一個發夾引物和配對的引物合成包含目標序列的模板DNA的互補鏈的工序，

將上述工序所得的混合物加熱至適當的變性溫度，使各引物與對象核酸退火，進行延伸反應的工序，

延伸的雙鏈擴增產物在變性條件下解離后，再次與各引物退火、延伸，重復進行在變性條件下解離后，再次與各引物退火、延伸的操作，得到含有發夾引物的環部的序列的雙鏈擴增產物的工序，

重復上述各工序，即合成互補鏈的工序、進行延伸反應的工序、得到雙鏈擴增產物的工序，得到具有發夾結構的單鏈核酸的工序，以及

該單鏈核酸以自身為模板進行延伸反應的工序；

得到成為生成物的核酸分子序列中包含目標序列及其互補鏈雙方，

所述發夾引物的莖部具有比單鏈部的Tm值高的Tm值，且以使從變性工序向退火和延伸工序的溫度降低的方式設置溫度梯度。

2.根據權利要求1所述的方法，在發夾引物由于反應的進行而減少的同時，合成的互補鏈序列以自身為模板進行延伸反應。

3.根據權利要求1所述的方法，進一步包括使用前將發夾引物的5'末端磷酸化，在構建目的核酸分子后使發夾引物5’末端磷酸化的DNA鏈分解的工序。

4.根據權利要求3所述的方法，使用λ外切核酸酶進行所述分解。

5.根據權利要求3所述的方法，在5’末端磷酸化的DNA鏈分解后，從其互補鏈的3’末端介由發夾結構自身退火進行延伸反應。

6.根據權利要求1所述的方法，進一步包括使具有發夾環結構的接頭與所述生成物連接，進行鏈置換反應而使核酸分子延伸的工序。

7.根據權利要求5所述的方法，使具有發夾環結構的接頭與所述生成物連接，進行鏈置換反應而使核酸分子延伸。

8.根據權利要求1所述的方法，將由所述配對的引物形成的末端固定，使互補鏈DNA解離后，進行延伸反應。

9.根據權利要求6或7所述的方法，所述接頭的環結構部含有延伸反應抑制分子。

10.根據權利要求1所述的方法，所述配對的引物具有DNA與RNA的嵌合結構，延伸反應后進一步包括使RNA分解的工序。

11.根據權利要求1所述的方法，所述發夾引物具有隨機序列。

12.根據權利要求11所述的方法，所述發夾引物具有所述目標序列的突變數量以上種類的隨機序列。

13.一種非診斷和治療目的的核酸堿基序列確定方法，其包括：

構建在序列中包含目標序列及其互補鏈雙方的單鏈核酸分子的工序，該構建包括：

使用3’側含有單鏈區域的至少一個發夾引物和配對的引物合成包含目標序列的模板DNA的互補鏈的工序，

將上述工序所得的混合物加熱至適當的變性溫度，使各引物與對象核酸退火，進行延伸反應的工序，

延伸的雙鏈擴增產物在變性條件下解離后，再次與各引物退火、延伸，重復進行在變性條件下解離后，再次與各引物退火、延伸的操作，得到含有發夾引物的環部的序列的雙鏈擴增產物的工序，

重復上述各工序，即合成互補鏈的工序、進行延伸反應的工序、得到雙鏈擴增產物的工序，得到具有發夾結構的單鏈核酸的工序，以及

該單鏈核酸以自身為模板進行延伸反應的工序；以及

利用納米孔測序儀對該單鏈核酸分子的堿基序列進行解析，

所述發夾引物的莖部具有比單鏈部的Tm值高的Tm值，且以使從變性工序向退火和延伸工序的溫度降低的方式設置溫度梯度。