[發明專利]核酸分子的構建方法

有效

• 申請號: 201680008496.4
• 申請日: 2016-02-26
• 公開（公告）號: CN107208162B
• 公開（公告）日: 2020-12-29
• 發明（設計）人: 藤岡滿
• 申請（專利權）人: 株式會社日立高新技術
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12N15/09
• 代理公司: 北京銀龍知識產權代理有限公司 11243
• 代理人: 金鮮英;宋海花

本發明提供一種單鏈核酸分子的構建方法，所述單鏈核酸分子用于利用納米孔測序儀進行的核酸序列確定，所述單鏈核酸分子的構建方法包括：使用3’側含有單鏈區域的至少一個發夾引物和配對的引物合成包含目標序列的模板DNA的互補鏈的工序、以及合成的互補鏈在分子內形成發夾結構并以自身為模板進行延伸反應的工序，得到的核酸分子序列中包含目標序列及其互補鏈雙方。通過設為單鏈結構，能夠利用納米孔測序進行解析，此外僅重復對不含互補鏈信息的目標核酸序列進行解析，因此能夠應對測序錯誤的問題，同時進行精度更高的解析。

技術領域

本發明涉及用于核酸序列確定的核酸分子的構建方法。更具體而言，涉及適合于利用納米孔測序進行解析的單鏈核酸分子的構建方法。

背景技術

近年來，以遺傳性疾病致病基因的檢測、藥物的有效性、副作用的評價、癌癥等相關的基因突變的檢測等為目的，核酸堿基序列解析的需求變得非常大。因此，解析結果得到的信息精度必須高。

作為高精度讀取核酸分子堿基序列的方法，例如，提出了模板核酸片段中核苷酸的共有序列的確定方法，包括將模板核酸片段的正義鏈和反義鏈配置于連續核酸分子的階段，以及通過利用聚合酶進行的依賴模板的測序方法對正義鏈和反義鏈雙方進行測序的階段(專利文獻1)。專利文獻1中記載了“利用模板的環狀構成，能夠進行同一分子的多次重復測序。換句話說，測序方法沿著完全連續的序列進行，通過重復對來自互補序列的各片段進行測序，可以重復獲得該片段的序列數據和各片段內的序列數據。這樣的序列數據的全部或一部分在之后衍生模板與其各種片段的共有序列中是有用的。”(段落編號[0055])。

此外，專利文獻2公開了含有雙鏈核酸區域的、可以為了制作用于序列確定目的的核酸單鏈構建物而使用的接頭。專利文獻2中記載了“構建物被確定序列時，確保雙鏈核酸中的各個位置并非僅檢查1次，實際上是檢查2次。這在對核酸的各位置進行檢查的基礎上實現了較高的可靠性，將通過一次檢查來實現，從而對于各位置中的兩種堿基，給予分數(Score)更高的綜合性識別(Call)。”(段落編號[0038])，進而還記載了“對各位置檢查2次的能力對于使用隨機感應對甲基胞嘧啶和胸腺嘧啶進行區別也是有用的。這兩種堿基在通過跨膜細孔或者與跨膜細孔相互作用時，具有非常類似的電流痕跡。因此，這會使對兩者進行區別變得困難。可是，通過對核酸各位置檢查2次，將能夠進行那樣的區別，因為，針對甲基胞嘧啶的互補堿基為鳥嘌呤，而針對胸腺嘧啶的互補堿基為腺嘌呤。毋庸置疑，甲基胞嘧啶與包括癌癥的各種疾病有關聯。”(段落編號[0042])。

現有技術文獻

專利文獻

專利文獻1:日本特表2011－515102號公報

專利文獻2:日本特表2012－516146號公報

發明內容

發明所要解決的課題

專利文獻1中記載的技術是將雙鏈核酸的一個末端用發夾環連接的分子、或將兩個末端用發夾環連接的環狀分子。一個末端連接的分子使用每次讀取互補鏈(正義鏈和反義鏈)各自的序列而得的兩個結果來提高堿基的判斷精度。然而，關于該方法，在一個核酸鏈中存在錯配堿基對那樣的突變的情況下、發生了測序錯誤的情況下，僅對互補鏈序列各讀取一次則互補鏈序列間的結果會產生差異。

產生了這樣的差異的情況下，無法判斷是該位置存在突變還是發生了測序錯誤，存在僅對互補鏈的堿基各檢查1次則無法進行具有高可靠性的解析的課題。此外，使兩個末端用發夾環連接的環狀分子中，有可能如現有技術文獻那樣通過多次反復測序來解決測序錯誤的問題，但在對單鏈核酸進行解析的納米孔測序方法中，存在無法對環狀分子進行解析的課題。