[發(fā)明專利]一種制備煙酰胺單核苷酸的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201680003986.5
• 申請(qǐng)日: 2016-07-30
• 公開（公告）號(hào): CN108026130B
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 傅榮昭;張琦
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 邦泰生物工程（深圳）有限公司
• 主分類號(hào): C07H1/00
• 分類號(hào): C07H1/00;C07H19/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

提供了一種制備煙酰胺單核苷酸的方法，其是以煙酰胺、ATP和核糖為原料，在煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及核糖激酶的催化作用下發(fā)生反應(yīng)，制得煙酰胺單核苷酸。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用生物催化技術(shù)制備煙酰胺單核苷酸的方法。

背景技術(shù)

煙酰胺單核苷酸(Nicotinamide mononucleotide，縮寫成NMN)是生物細(xì)胞內(nèi)存在的一種生化物質(zhì)，它在被煙酰胺核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶腺苷化后即轉(zhuǎn)化成生物細(xì)胞所賴以生存的重要物質(zhì)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，又稱輔酶I)，并且同時(shí)直接參與體內(nèi)腺苷轉(zhuǎn)移，其在生物細(xì)胞內(nèi)的水平直接影響到NAD的濃度，在生物細(xì)胞能量生成中扮演著重要角色，并且對(duì)人體無危害。

截至目前，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)煙酰胺單核苷酸具有諸如延緩衰老、治療帕金森等老年病、調(diào)節(jié)胰島素分泌、影響mRNA的表達(dá)等諸多醫(yī)療保健用途，更多的用途還在不斷研發(fā)出來。隨著人們對(duì)煙酰胺單核苷酸藥用及保健效果認(rèn)知的增加，以及作為一種反應(yīng)底物在化工方面的廣泛應(yīng)用，市場(chǎng)上對(duì)煙酰胺單核苷酸的需求量與日俱增。

目前，NMN的制備方法主要包括以下三種：1、酵母菌發(fā)酵法；2、化學(xué)合成法；3、生物催化法。其中，化學(xué)合成法具有成本較高且產(chǎn)生手性化合物的缺點(diǎn)；而酵母菌發(fā)酵法生產(chǎn)的NMN含一定有機(jī)溶劑殘留；生物催化法因不含機(jī)溶劑殘留，也不存在手性問題且制備的NMN與機(jī)體內(nèi)的同型而成為目前最綠色環(huán)保無公害的NMN的制備方法。現(xiàn)有的制備NMN的生物催化法一般是以煙酰胺和5′- 磷酸核糖基-1′-焦磷酸(PRPP)為底物，在煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Nicotinamid e phosphoribosyltransferase，縮寫成Nampt)的催化下制備NMN。但是，因PRPP 的市場(chǎng)價(jià)格較高且來源受限，導(dǎo)致該生物催化法的生產(chǎn)成本較高，嚴(yán)重制約了其應(yīng)用和發(fā)展。

因此，有必要開發(fā)一種無需使用PRPP作為底物的利用生物催化技術(shù)制備NMN 的新方法。

技術(shù)問題

針對(duì)上述背景技術(shù)中提到的現(xiàn)有的煙酰胺單核苷酸的制備方法存在的諸多問題，本發(fā)明的目的在于提供一種利用生物催化技術(shù)制備NMN的新方法，該方法可避開使用價(jià)格較高且來源受限的PRPP作為底物，具有價(jià)格低廉、綠色環(huán)保無公害、適宜大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。

問題的解決方案

技術(shù)解決方案

為實(shí)驗(yàn)上述目的，發(fā)明人經(jīng)過長期大量的實(shí)驗(yàn)摸索，終于開發(fā)出一種制備煙酰胺單核苷酸的方法，其特征在于：以煙酰胺、ATP和核糖為原料，在煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及核糖激酶的催化作用下發(fā)生反應(yīng)，制得煙酰胺單核苷酸。

根據(jù)酶的國際系統(tǒng)命名法，上述方法中所使用的酶的EC編號(hào)分別為：煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶EC 2.4.2.12，核糖磷酸焦磷酸激酶EC 2.7.6.1，核糖激酶EC 2.7.1.15。

上述方法中所使用的各種酶的具體存在形式包括酶液、酶凍干粉、含酶細(xì)胞以及各種固定化酶和固定化含酶細(xì)胞，可以是未經(jīng)純化的粗酶形式，也可以是經(jīng)部分純化或完全純化的形式。

為提高所使用酶的穩(wěn)定性和重復(fù)利用率，以更好地完成上述催化反應(yīng)并更進(jìn)一步降低成本，上述方法中優(yōu)選使用固定化酶。該固定化酶的制備方法大致為：用洗酶緩沖液(0.02M Tris-HCl/0.001M EDTA，pH7.0溶液)將酶稀釋至蛋白含量為5-10mg/ml，再將酶稀釋液與PB溶液(2.0mol/L磷酸二氫鉀，pH7.5)等體積混合，然后加入酶固定化載體(50毫克酶/克載體)，于搖床(轉(zhuǎn)速150rpm)中2 5℃反應(yīng)20小時(shí)。反應(yīng)完成后用濾袋過濾，用洗酶緩沖液清洗5-6次，即得固定化酶。其中的酶固定化載體可以選用環(huán)氧型LX-3000、二氧化硅、活性炭、玻璃珠以及大孔型聚N-氨乙基丙烯酰胺-聚乙烯等。

優(yōu)選地，所述反應(yīng)在溫度為30-50℃，pH值為6.5-8.5的條件下進(jìn)行。