[發明專利]寨卡病毒多片段融合蛋白的制備及IgG/IgM抗體檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201611272846.6
• 申請日: 2016-12-30
• 公開（公告）號: CN106841601A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 吳英松;鄧傳歡;董志寧;李志雄
• 申請（專利權）人: 廣州市達瑞生物技術股份有限公司
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/531;G01N33/577;G01N33/569
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技術領域

本發明數據生物技術領域，涉及一種利用基因工程多片段融合快速表達技術制備寨卡病毒診斷抗原，及寨卡病毒IgG/IgM抗體快速檢測試劑盒(膠體金法)的制備及其使用。

背景技術

2015年，寨卡病毒在全球快速蔓延，已有24個國家和地區出現疫情報道，世界衛生組織于2016年2月1日宣布，將寨卡病毒及小頭癥列為全球緊急公共衛生事件。

寨卡病毒病(Zika virus disease)屬于黃熱病毒科的黃病毒屬，是由寨卡病毒(Zika virus)，引起的一種自限性急性傳染病。寨卡病毒通過受到感染的伊蚊屬蚊子叮咬傳播到人，還可能由懷孕的母親在懷孕或生產過程中傳播給胎兒或嬰兒，也可能發生性傳播，或輸血傳播。感染后，僅有20％的患者出現癥狀，包括發熱、皮癥、結膜炎、肌肉和關節痛、全身乏力以及頭痛等，這些癥狀通常持續2～7天。寨卡病毒可能會造成神經和自身免疫系統的并發癥，如格林-巴利綜合征(Guillian-Barré syndrome)，孕婦感染寨卡病毒可能引起嬰兒小頭畸形。

目前，全世界已發現超過4000例新生兒小頭畸形病例。我國已發現輸入病例共8例。寨卡病毒在全球流行態勢已異常嚴峻。因此，需要一種快速、簡便、特異的檢測試劑盒來應對。而寨卡病毒與同種屬的登革熱病毒有很高的同源性，且兩種病毒均是經蚊蟲傳播，因此，如何能區別開寨卡病毒和登革熱病毒感染就顯得尤為重要。

近期，也有些國內外的廠家寨卡病毒診斷抗原問世，但往往由于抗原上游的基因序列對應的抗原表位未做任何修飾，導致不可避免的與登革熱病毒的交叉反應。

因此，本發明利用生物信息學分析技術對寨卡病毒和登革熱病毒進行表位分析，選取差異表位，然后利用一步法融合表達技術對特異的抗原表位進行融合表達，分別比較其診斷效果，并最終選定靈敏度高、特異性強(與登革熱病毒無交叉反應)的融合蛋白作為診斷抗原。

免疫膠體金技術作為一種近年來免疫類新技術發展十分迅速，在生物醫學各研究領域特別是在醫學檢驗中得到了日益廣泛的應用，它具有操作簡單、檢測快速、特異性好、靈敏度高的優點。

在此基礎上，利用快速簡便的膠體金技術進行試劑盒的制備，讓寨卡病毒的診斷更加靈敏、特異、便捷，從而更好地為公眾健康提供快速檢測技術。

本發明即是利用基因工程融合表達技術及膠體金方法學的優勢，研制成功一種可區別登革熱病毒感染的寨卡病毒的快速診斷試劑盒。本試劑盒具有靈敏度高、特異性強、穩定性好、操作簡便及成本低廉等顯著優點。

發明內容

本發明的目的在于提供一種簡便快速的寨卡病毒檢測試劑盒(膠體金法)。該試劑盒采用自主研發優選的融合表達蛋白作為診斷抗原，抗人IgG單克隆抗體A374、抗人IgM單克隆抗體A371和生物素-BSA偶聯物分別包被在硝酸纖維素膜上作為檢測線和質控線，配以膠體金標記的融合表達蛋白和膠體金標記的鏈霉親和素及其他試劑，采用免疫層析捕獲法原理定性檢測人血清中的寨卡病毒特異性的IgM抗體、IgG抗體，從而實現寨卡病毒感染的快速、特異診斷。

本發明在于應用生物信息學技術分析比較寨卡病毒與登革熱病毒基因序列，選取寨卡病毒特有的線性表位進行多表位融合表達純化，并優選出重組蛋白ZIKV-Ag2作為診斷抗原，用膠體金標記來檢測樣本中寨卡病毒。

本發明的試劑盒包括1)檢測試劑卡、2)樣品處理液和3)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。其中，檢測試劑卡由1)樣品墊、2)膠體金結合墊、3)層析膜、4)吸水材料和5)襯板組成，且上述1)～4)首尾互相銜接并附著在5)上；且所述膠體金結合墊為包被有金標記融合抗原ZIKV-Ag2以及金標記鏈霉親和素的玻璃纖維膜；層析膜為包被有抗人IgG單克隆抗體A371、抗人IgM單克隆抗體A372、生物素-BSA的硝酸纖維素膜；襯板為PVC材質；樣品處理液由1～50mg/mL的異嗜性抗體阻斷劑和0.02％～0.06％NaN₃防腐劑組成。

為了實現本發明，發明人采用了以下技術方案：

(1)生物信息學比對：選取寨卡病毒與登革熱病毒基因全長序列進行生物信息學比對分析，分析寨卡病毒特異的線性抗原表位；

(2)特異基因片段的組合：篩選出寨卡病毒特異的線性抗原表位對應的基因片段序列1、2、3；并對片段1、2、3分別進行單獨或組合，分別為：

①片段1；

②片段2；

③片段3；

④片段1+片段2融合；

⑤片段1+片段3融合；