[發明專利]人類多能干細胞來源的人類心室肌細胞的篩選及制備方法

在審

• 申請號: 201611271273.5
• 申請日: 2016-12-30
• 公開（公告）號: CN108265029A
• 公開（公告）日: 2018-07-10
• 發明（設計）人: 孫寧;李賓;楊慧;梁倩倩
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

本發明屬生物醫學研究與應用領域，涉及人類多能干細胞來源的人類心室肌細胞的篩選及制備方法，本發明從人類多能干細胞定向分化形成心肌細胞后對人類心室肌細胞進行特異性篩選純化及大量制備。本發明利用基因組編輯技術，構建MYL2基因結尾攜帶新霉素或綠色熒光蛋白篩選基因的人類多能干細胞細胞系，并定向誘導分化為心肌細胞，進而通過新霉素或綠色熒光蛋白篩選基因純化得到人類心室肌細胞，其可與任意支架材料結合培養形成性質不同的各種工程化人類心室肌組織。本發明的人類心室肌細胞具備與正常人類心室肌細胞相似的表型及電生理反應，來源廣泛，且能長期體外培養。為針對心室肌損傷與疾病的治療手段和篩選有效的藥物提供了良好的平臺。

技術領域

本發明屬生物醫學研究與應用領域，具體涉及通過人類多能干細胞定向分化心肌細胞后進行心室肌細胞的篩選及制備方法。

背景技術

現有技術公開了心血管疾病是危害人類健康的“頭號殺手”，據世界衛生組織(WHO)統計，全球每年死于心血管疾病的人數高達1710萬，占全球死亡人數的29％，并以每年10.42％的速度遞增發病率和致死率呈逐年增長態勢，防治現狀堪憂。雖然傳統的藥物治療、介入治療和搭橋手術等方法的應用改善了缺血性心臟病患者的預后，但仍無法挽救已經死亡的心肌細胞、逆轉心室重構及后續的心力衰竭。心肌缺血、梗死后心肌修復和功能重建已成為該領域全球性的難題，亟需探索新的治療方法和途徑。由人類心臟解剖與冠狀動脈的生理特點所決定，目前絕大多數的心肌梗死患者其心肌壞死的部位都位于心室肌，因此，未來心臟的再生治療對于患者自體的心室肌細胞有很大的需求。

研究顯示，絕大多數的心肌細胞都處于終末分化狀態，自我再生的能力十分有限；而多能性干細胞(包括人類胚胎干細胞(hESCs)和誘導多能性干細胞(hiPSCs))具有多向分化潛能及自我更新能力，可以無限增值，理論上可以分化為成年人類任何一種的體細胞。因此將多能性干細胞定向分化心血管系統細胞，通過心肌再生和血管新生等機制替代梗死的心肌組織，逐漸成為極有前景的心臟疾病治療新方法。

目前，雖然已有若干關于多能干細胞往心肌細胞方向分化方法的報道，但分化的心肌細胞純度往往不夠，一般含有一定比例的心室肌細胞、心房肌細胞、成纖維細胞，平滑肌細胞，內皮細胞，竇房結起搏細胞，這些混合性的細胞植入心梗動物中引起心律失常，導致模型動物死亡。

基于現有技術的現狀，本申請的發明人擬提供人類多能干細胞來源的人類心室肌細胞的篩選及制備方法，通過定向分化和藥物篩選或者流式分選獲得沒有自主搏動的高純度人類心室肌細胞，將可用于未來的自體心室肌細胞移植。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術存在的缺陷針對目前心室肌細胞來源的限制，提供人類多能干細胞來源的人類心室肌細胞的篩選及制備方法。利用基因工程手段，建立一組MYL2基因結合新霉素(Neomycin)和MYL2基因結合綠色熒光蛋白(eGFP)的多能干細胞細胞株，通過定向分化和藥物篩選或者流式分選獲得沒有自主搏動的高純度人類心室肌細胞，可用于未來的自體心室肌細胞移植?；蛘呓Y合組織工程學，生產制備有功能的可用于移植的工程化人造人類心室肌組織。

本發明利用基因編輯技術如TALEN或CRISPR/CAS9技術介導基因重組，將帶有用于心室肌細胞篩選標記的新霉素或綠色熒光蛋白篩選基因，導入人類多能干細胞(包括人類胚胎干細胞和誘導多能性干細胞)基因組中特定的MYL2基因位點之后，建立用于人類心室肌篩選的多能干細胞株，進而通過多能干細胞定向分化心肌細胞技術(該技術為已公開的成熟技術，具體實施步驟見Lian et al.，Nature Protocols，2012；8：162-75)，通過新霉素藥物篩選或綠色熒光蛋白流式分選制備可用于研究與應用的人類心室肌細胞。

具體的，本發明提供了人類多能干細胞定向分化心肌細胞后的人類心室肌細胞的篩選純化方法，其特征在于，利用基因組編輯技術，如TALEN、CRISPR/CAS9或任何有效的基因重組技術，編輯人類多能干細胞基因組，構建特定的MYL2基因結尾攜帶新霉素或綠色熒光蛋白篩選基因的人類多能干細胞細胞株，其包括步驟：