[發明專利]人類多能干細胞來源的人類心室肌細胞的篩選及制備方法

在審

• 申請號: 201611271273.5
• 申請日: 2016-12-30
• 公開（公告）號: CN108265029A
• 公開（公告）日: 2018-07-10
• 發明（設計）人: 孫寧;李賓;楊慧;梁倩倩
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

1.人類多能干細胞來源的人類心室肌細胞的篩選及制備方法，其特征在于，利用基因組編輯技術，編輯人類多能干細胞基因組，構建特定的MYL2基因結尾攜帶新霉素或綠色熒光蛋白篩選基因的人類多能干細胞細胞株，其包括步驟：

A、構建針對靶基因MYL2的TALEN或CRISPR/CAS9基因組編輯質粒；

B、構建帶有步驟A所述靶基因的同源基因結合新霉素或綠色熒光蛋白篩選標記的供體質粒；

C、培養良好的未分化的不同來源的人類多能干細胞，其中包括制備的人類胚胎干細胞與通過體外重編程正常人類個體的體細胞獲得的人類誘導多能性干細胞人iPS細胞；

D、將步驟A獲得的TALEN或CRISPR/CAS9基因組編輯質粒與步驟B獲得的MYL2同源基因供體質粒共電轉入人類多能干細胞，通過基因重組將MYL2同源基因結合新霉素或綠色熒光蛋白篩選標記導入人類多能干細胞的基因組；

E、通過基因測序與單克隆篩選獲得成功同源重組的帶有MYL2結合新霉素或綠色熒光蛋白篩選標記的人類多能干細胞，并建立相應細胞株；

F、將步驟E所述獲得的帶有MYL2結合藥物或熒光篩選標記的人類多能干細胞細胞株，通過人類多能干細胞定向分化心肌細胞技術，得到未經過篩選純化的人類心肌細胞；

G、將步驟F中未經篩選純化的分化后的人類心肌細胞，通過新霉素藥物篩選或綠色熒光蛋白流式細胞儀分選進行純化；

H、將步驟G中所述的經過新霉素或綠色熒光蛋白篩選的人類心室肌細胞進行驗證，得具有正常人類心室肌細胞的相應表型。

2.按權利要求1所述的人類多能干細胞來源的人類心室肌細胞的篩選及制備方法，其特征在于，獲得的人類多能干細胞細胞株為帶有MYL2基因結合新霉素或綠色熒光蛋白篩選標記的人類多能干細胞細胞株。

3.按權利要求1所述的人類多能干細胞來源的人類心室肌細胞的篩選及制備方法，其特征在于，所述的基因組編輯技術選自TALEN、CRISPR/CAS9或任何有效的基因重組技術。

4.按權利要求1所述的人類多能干細胞來源的人類心室肌細胞的篩選及制備方法，其特征在于，所述的步驟A中，靶基因MYL2編輯的蛋白為心室肌細胞的特異標志物。

5.按權利要求1所述的人類多能干細胞來源的人類心室肌細胞的篩選及制備方法，其特征在于，所述的步驟F中，得到的未經過篩選純化的人類心肌細胞，包括人類心室肌細胞、心房肌細胞、竇房結起搏細胞、以及屬于人類心臟內其他類別的細胞。

6.按權利要求1所述的人類多能干細胞來源的人類心室肌細胞的篩選及制備方法，其特征在于，所述的步驟F中，所述的純化后使人類心室肌細胞的比例達到95％以上。

7.權利要求1所述的篩選及制備方法，其中所述的人類多能干細胞細胞株在用于制備人類心臟病病人心臟活體移植制品中的用途。

8.權利要求1所述的篩選及制備方法，其中所述的人類多能干細胞細胞株在用于制備體外工程化人類心室肌組織中的用途，其中，將分化與篩選純化獲得的人類心室肌細胞與支架材料結合，培養形成體外工程化人類心室肌組織。