[發明專利]親水性納米復合材料結合質譜分析鑒定糖基化肽段的方法

有效

• 申請號: 201611270469.2
• 申請日: 2016-12-30
• 公開（公告）號: CN106770614B
• 公開（公告）日: 2019-11-12
• 發明（設計）人: 張祥民;馮小燕
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: G01N27/62
• 分類號: G01N27/62
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;陸尤

本發明屬于納米技術領域，具體為一種親水性納米復合材料結合質譜分析鑒定糖基化肽段的方法。本發明將納米復合材料配制成為分散液，溶劑為超純水，將該分散液與糖基化肽段溶液在80%乙腈/0.1%甲酸緩沖液中混合，在酶解儀中孵育；在外磁場作用下通過磁性分離納米復合材料，用80%乙腈/0.1%甲酸緩沖液洗滌；再用50%乙腈/0.1%甲酸緩沖液洗脫材料上富集的糖基化肽段，結合質譜分析鑒定。該親水性納米復合材料為磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化銨)和納米金顆粒并修飾葡萄糖的納米復合材料。本方法操作簡單，成本低廉，靈敏迅速，具有較高靈敏度和較好選擇性，十分適用于復雜生物樣品中的糖基化肽段的檢測。

技術領域

本發明屬于納米技術領域，具體涉及一種親水性納米復合材料結合質譜分析鑒定糖基化肽段的方法，特別是涉及一種磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化銨)和納米金顆粒并修飾葡萄糖的復合納米材料結合質譜技術用于糖基化肽段富集與檢測的方法。

背景技術

蛋白質糖基化是生命過程中最重要的翻譯后修飾手段之一，在分子識別、細胞內及細胞間信號傳導、免疫反應等生命活動中起到了重要的作用。根據Swiss-Prot數據庫的記錄和預測，人類蛋白質中約有一半以上的蛋白質發生了糖基化。糖蛋白的組成、豐度的變化與疾病有著密切的聯系，特別是在癌癥發展過程之中，許多臨床診斷標志物和治療靶標如乳腺癌中的Her2/neu、前列腺癌中的前列腺特異性抗原、卵巢癌中的CA125等都是糖蛋白。因此，全面的分析研究蛋白質糖基化對于深入了解細胞生物學和疾病機理非常關鍵。目前，快速、高精度、操作簡便的質譜技術在糖基化蛋白質組學的研究中得到了廣泛的應用。然而，糖蛋白質組學的全面研究仍然存在著很多困難。很多臨床上具有重要研究價值的糖蛋白均是低豐度蛋白，容易受到生物樣品中其他高豐度非糖蛋白的干擾；糖蛋白或糖肽的離子化效率遠遠低于非糖蛋白或非糖肽，降低了糖蛋白或糖肽的質譜檢測靈敏度；糖鏈結構復雜多樣，質譜難以準確測定其化學結構和質量數。因此，在使用質譜方法分析復雜生物樣品中的糖蛋白或糖肽之前，對樣品中的糖蛋白或者糖基化肽段進行分離富集是十分必要的。

隨著研究的不斷深入，近年來發展了許多分離富集復雜樣品中的糖基化蛋白和肽段的方法，比如凝集素親和方法、抗體法、酰肼化學反應法、硼酸親和色譜法、二氧化鈦親和法、親水相互作用色譜法（HILIC）等。其中，親水相互作用色譜法由于廣泛的糖鏈特異性、富集過程簡便、富集條件溫和、重現性高而得到廣泛應用；此外，HILIC方法利用高濃度的有機溶劑作為流動相，可以很好地兼容后續的質譜分析。目前HILIC方法已經開發出各種材料用于糖肽富集，包括瓊脂糖，麥芽糖，兩性離子聚合物和金屬有機骨架等。由于葡萄糖、麥芽糖等和糖肽有相似結構，所以利用葡萄糖、麥芽糖等功能化修飾的HILIC材料與糖肽會有較好的相互作用。

石墨烯是一種新型的單原子層碳納米材料，由于其獨特的理化性能、超高的比表面積備受關注。磁性材料由于超順磁性、快速分離、良好的生物相容性在蛋白質組學領域得到廣泛應用。因此，基于磁性石墨烯基底的親水性復合納米材料在糖肽富集研究中有很大的潛力。

通過文獻調研，目前還沒有葡萄糖功能化修飾的磁性石墨烯材料應用在糖肽的富集研究中。結合磁性石墨烯材料超大比表面、快速分離等特點和葡萄糖特異性親和糖肽特點，本發明首次合成了磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化銨)和納米金顆粒并修飾葡萄糖的納米復合材料，應用于糖基化肽段的分離富集。大比表面積的磁性石墨烯材料通過聚(二烯丙基二甲基氯化銨)的靜電吸附作用負載納米金顆粒，再結合金-硫鍵相互作用在材料表面充分修飾了巰基化的葡萄糖，形成了具有很好親水性的復合材料，對于復雜生物樣品中的糖基化肽段具有選擇性富集作用，大大提高了糖基化肽段的質譜信號，對于糖基化肽段的檢測限可達0.25 fmol/μL，檢測絕對量達到1ng。

本發明所涉及的磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化銨)和納米金顆粒并修飾葡萄糖的親水性納米復合材料，具有大比表面積，良好的生物相容性，快速磁性分離能力以及優異的親水性，合成方法簡單快速。此親水性納米復合材料可用于選擇性富集生物樣品中低豐度的糖基化肽，并用于質譜檢測。

發明內容