[發(fā)明專利]親水性納米復(fù)合材料結(jié)合質(zhì)譜分析鑒定糖基化肽段的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611270469.2
• 申請(qǐng)日: 2016-12-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106770614B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-11-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張祥民;馮小燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N27/62
• 分類號(hào): G01N27/62
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;陸尤

1.一種親水性納米復(fù)合材料結(jié)合質(zhì)譜分析鑒定糖基化肽段的方法，其特征在于，具體步驟如下：

（一）將親水性納米復(fù)合材料配制成為0.5-10mg/mL的分散液，溶劑為超純水，將該分散液與糖基化肽段溶液加入到上樣緩沖液中混合，在酶解儀中孵育15-60分鐘；該上樣緩沖液由超純水配制，在100 ml上樣緩沖液中有75ml~90ml乙腈、0.05ml~1ml甲酸與79mg~197.5mg碳酸氫銨；

（二）在外磁場(chǎng)作用下通過(guò)磁性分離納米復(fù)合材料，用緩沖液洗滌，該緩沖洗滌液用超純水配制，100ml緩沖洗滌液中含有75ml~90ml乙腈、0.05ml~1ml甲酸與79mg~197.5mg碳酸氫銨；隨后用混合液洗脫，該混合洗脫液用超純水配制，100ml混合洗脫液中含有30ml~55ml乙腈、0.05ml~1ml甲酸緩沖液與79mg~197.5mg碳酸氫銨；

（三）取1-3μL洗脫液直接在MALDI-TOF MS的進(jìn)樣靶板上點(diǎn)靶，干燥后再點(diǎn)加1-2μL濃度為15-25mg/mL的2，5-二羥基苯甲酸溶液，形成基質(zhì)結(jié)晶，進(jìn)行質(zhì)譜分析；

其中，所述的納米復(fù)合材料為磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化銨)和納米金顆粒并修飾葡萄糖的親水性納米復(fù)合材料。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的親水性納米復(fù)合材料結(jié)合質(zhì)譜分析鑒定糖基化肽段的方法，其特征在于，所述的親水性納米復(fù)合材料具體制備步驟如下：

（1）用濃硝酸對(duì)石墨烯進(jìn)行酸化，在55-65℃條件下反應(yīng)6-8小時(shí)得到酸化石墨烯，隨后用去離子水充分洗滌酸化石墨烯，到洗滌液呈中性為止，在40-60℃下真空干燥；

（2）步驟（1）所得的酸化石墨烯加入乙二醇中，加入六水合三氯化鐵，超聲分散0.5-1.5小時(shí)，再加入檸檬酸三鈉，乙酸鈉和聚乙二醇，室溫下攪拌0.5-1小時(shí)后把混合物轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼反應(yīng)釜中，190-210℃條件下反應(yīng)8-16小時(shí)，制得磁性石墨烯，在外磁場(chǎng)作用下將產(chǎn)物從反應(yīng)溶液中磁性分離，用去離子水和無(wú)水乙醇充分洗滌，在40-60℃下真空干燥；

（3）配制氯金酸水溶液，磁力攪拌并加熱至沸騰，再向其中加入檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)攪拌保持沸騰10-30分鐘，然后自然冷卻至室溫，得到納米金的水溶膠；

（4）配制含有三羥甲基氨基甲烷和氯化鈉的溶液，再加入聚（二烯丙基二甲基氯化銨）溶液形成混合液，向混合液中加入步驟（2）所得的磁性石墨烯，超聲分散，再機(jī)械攪拌30-45分鐘，在外磁場(chǎng)作用下磁性分離并用去離子水充分洗滌；向洗滌后的反應(yīng)物中加入步驟（3）所得納米金的水溶膠，室溫下機(jī)械攪拌1-4小時(shí)，得到納米金顆粒修飾的聚（二烯丙基二甲基氯化銨）包覆的磁性石墨烯，在外磁場(chǎng)作用下將產(chǎn)物從反應(yīng)溶液中磁性分離，用去離子水充分洗滌，在40-60℃下真空干燥；

（5）配制磷酸鹽緩沖液，加入2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷鹽酸鹽和氨基葡萄糖鹽酸鹽，在酶解儀上37-60℃反應(yīng)30-60分鐘，向其中加入步驟（4）所得產(chǎn)物納米金顆粒修飾的聚（二烯丙基二甲基氯化銨）包覆的磁性石墨烯，50-70℃反應(yīng)1-3小時(shí)，在外磁場(chǎng)作用下將產(chǎn)物從反應(yīng)溶液中磁性分離，用去離子水充分洗滌，在40-60℃下真空干燥，得到磁性石墨烯表面包覆聚（二烯丙基二甲基氯化銨）和納米金顆粒并修飾葡萄糖的親水性復(fù)合納米材料；

步驟（1）中石墨烯和濃硝酸的比為（0.3-2）g：（30-130）mL；

步驟（2）中酸化石墨烯、乙二醇、六水合三氯化鐵、檸檬酸三鈉、乙酸鈉和聚乙二醇的比為（50-500）mg：（15-150）mL：（130-1000）mg：（50-500）mg：（600-6000）mg：（300-3300）mg；

步驟（3）中氯金酸、水和檸檬酸三鈉的比為（2-10）mg：（20-100）mL：（4-20）mg；

步驟（4）中三羥甲基氨基甲烷，氯化鈉和聚（二烯丙基二甲基氯化銨）的濃度比為（0.01-0.05）mol/L：（0.01-0.05）mol/L：（0.1-0.5）% ；

步驟（4）中磁性石墨烯和納米金水溶膠的比為（5-50）mg：（15-250）mL；

步驟（5）中磷酸鹽緩沖液的pH值為7.2-7.4；

步驟（5）中2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷鹽酸鹽和氨基葡萄糖鹽酸鹽的質(zhì)量比為（4.8-5.2）：（2.7-3.2）；

步驟（5）中氨基葡萄糖鹽酸鹽和步驟（4）所得產(chǎn)物納米金顆粒修飾的聚（二烯丙基二甲基氯化銨）包覆的磁性石墨烯的質(zhì)量比為（0.7-1.2）：（0.9-1.4）。