[發明專利]PEG修飾蛋白的PEG結合數檢測方法

有效

• 申請號: 201611270257.4
• 申請日: 2016-12-31
• 公開（公告）號: CN108267590B
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發明（設計）人: 馬永;顏莎;王俊
• 申請（專利權）人: 江蘇眾紅生物工程創藥研究院有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N1/38
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及PEG修飾蛋白的PEG結合數檢測方法，包括以下步驟：待測PEG修飾蛋白樣品處理后將PEG全部釋放出來，檢測PEG的質量，通過蛋白及PEG的摩爾比推算出PEG修飾蛋白中PEG結合數的步驟。本發明方法適用于不同的蛋白類型及不同PEG修飾劑類型，尤其是由立體結構復雜、分子量龐大，空間位阻較大的PEG修飾的蛋白，其用其他現有方法難以準確分析PEG結合數。并且，本發明方法操作簡單、重復性好、能準確分析PEG修飾蛋白PEG結合數。

技術領域

本發明涉及藥物分析領域，具體涉及PEG修飾蛋白的PEG結合數檢測方法。

背景技術

藥用蛋白和多肽普遍存在生物穩定性差、體內半衰期短和具免疫原性等缺點，通常采用基因工程改造和化學修飾等手段對其進行改造修飾以克服上述缺點。聚乙二醇(PEG)是一種線性、在溶液中可自由卷曲的不帶電荷的聚合物，具有無毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性。用它來共價修飾蛋白質，可以增加蛋白質的體內循環半衰期和減小其抗原性，增加蛋白質的溶解性并會改變蛋白質在人體內的生物學分布。自1977年Abuchowski，Davis(J.Biol.Chem.1977,252:3578-3581.)等人首次報道用PEG修飾蛋白質以來，PEG已經被廣泛地應用于蛋白多肽類藥物的修飾研究，蛋白質PEG化技術已經成為降低蛋白質生物藥物的免疫原性、改善其藥代動力學/藥效學性質最有效的方法之一。

由于蛋白質上可以發生PEG修飾的位點較多，因此，反映PEG對蛋白質修飾程度的平均修飾率或PEG結合數，對該類藥物構效關系研究與質量控制具有重要意義。

修飾蛋白藥物的PEG結合數的檢測方法有：三硝基苯磺酸法(TNBS法)、熒光胺法、核磁共振、毛細管電泳(CE)、基質輔助激光掃描系統(MALDI-MS)，傅里葉變換紅外光譜(FTIR)、拉曼散射光譜等。根據方法的簡單和易操作性，其中三硝基苯磺酸法(TNBS法)和熒光胺法較常用，它們的原理都是通過檢測游離氨基數來反推蛋白的PEG結合數。但對于立體結構復雜、分子量龐大，空間位阻較大的PEG，TNBS法和熒光胺法很難結合到包裹在蛋白高級結構內部的游離氨基，從而不能準確分析檢測PEG結合數。

發明內容

為克服上述技術問題，本發明提供可以準確檢測聚乙二醇修飾蛋白中PEG結合數的方法。

本發明的PEG修飾蛋白中PEG結合數的檢測方法，該方法直接檢測PEG修飾蛋白中PEG的量來確定PEG結合數，包括以下步驟：待測樣品處理的步驟、對處理后的樣品測算游離PEG含量的步驟、根據游離PEG含量推算出PEG修飾蛋白中PEG結合數的步驟。

所述的待測樣品處理步驟是將PEG修飾蛋白藥物中的PEG完全從蛋白藥物分子上釋放出來。釋放出來的PEG可以不帶任何多肽或氨基酸，也可以連接有多肽或氨基酸。

優選的，所述的待測樣品處理步驟是采用了蛋白酶解方法將蛋白藥物水解成多肽或氨基酸，所述的蛋白酶是胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶或彈性蛋白酶，并不限于實施例使用的胰蛋白酶。

更優選的，所述的待測樣品處理步驟是先用高溫破壞PEG修飾蛋白的高級結構，然后用蛋白酶水解蛋白質成多肽或是氨基酸，釋放出與蛋白結合的PEG。

發明人還嘗試了其他方法，如酸堿水解、加熱等亦能達到使PEG完全從蛋白分子上釋放出來的目的。本發明的樣品處理也不限于上述方法，只要是本領域技術人員公知的能夠實現將PEG完全從蛋白分子上釋放出來的方法都可用于本發明的樣品處理。

優選的，所述的對處理后的樣品測算游離PEG含量的步驟，可以是硫氰鐵銨-氯仿兩相體系法，中國藥典第四部通則3202聚乙二醇殘留量測定法，或者是SDS-PAGE電泳法。