[發明專利]一種用于快速判斷小分子結合人體肝臟果糖1;6-二磷酸酶底物位點或變構位點的方法

有效

• 申請號: 201611270093.5
• 申請日: 2016-12-30
• 公開（公告）號: CN106770122B
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發明（設計）人: 萬堅;黃運遠;徐榕;韓新亞;肖閃;任彥亮;馮玲玲;饒立
• 申請（專利權）人: 華中師范大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 喬宇;徐曉琴

本發明屬于小分子結合酶位點技術領域，具體涉及了一種用于快速判斷小分子結合人體肝臟果糖1,6?二磷酸酶底物位點或變構位點的方法。本發明采用氨基酸定點突變技術將果糖1,6?二磷酸酶的蛋白序列262位(底物位點)的苯丙氨酸突變為色氨酸，記為蛋白F262W；將果糖1,6?二磷酸酶的蛋白序列89位(變構位點)的苯丙氨酸突變為色氨酸，記為蛋白F89W；利用小分子與蛋白F262W或蛋白F89W結合，引起蛋白周圍環境發生變化，使得熒光發生猝滅，通過判斷熒光猝滅的情況實現快速簡便的判斷小分子是否與果糖1,6?二磷酸酶的底物位點或變構位點結合，本發明方法具有特異性好，靈敏度高的優點。

技術領域

本發明屬于小分子結合酶位點技術領域，具體涉及了一種用于快速判斷小分子結合人體肝臟果糖1,6-二磷酸酶底物位點或變構位點的方法。

背景技術

二型糖尿病正在成為世界范圍性的疾病，預計到2030年，全球將有3.66億人得糖尿病。糖尿病患者長期存在的高血糖，會損害人體內的各種器官組織，例如眼睛、腎、神經、心臟、還有血管。糖尿病的發病機理主要為胰島素分泌不足，胰島素抵抗和肝葡萄糖生成增加。此外，內源性的葡萄糖生成增加是造成糖尿病患者空腹血糖升高的主要原因。內源性的葡萄糖主要來源于肝臟。肝臟內葡萄糖代謝主要為兩個途徑，一個是糖異生過程，另一個是肝糖原分解。因此通過調節糖異生途徑，減少肝臟葡萄糖的生成，成為開發新作用機制抗糖尿病藥物的新策略。

糖異生作用是將乳酸，丙三醇等三碳前體，在多種酶的催化下轉化為葡萄糖的過程。在糖異生過程中，果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)催化果糖1,6-二磷酸生成果糖-6-磷酸和一分子磷酸。該催化反應是糖異生過程中的一個控速步驟，抑制果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)的活性，可以減少肝臟葡萄糖的生成，降低血糖水平，達到治療糖尿病的目的。

果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)是一個同源四聚體，由四個結構相同的單位組成。每個單體結構中含有兩個結合位點：底物位點和AMP變構位點。目前已經報道了許多化合物對果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)有抑制作用。而清楚明確的知曉小分子和果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)的結合位點對于小分子的設計改造至關重要。而目前判斷小分子和果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)結合位點主要有：1.X-Ray晶體體衍射法；2.表面等離子共振；3.同位素標記法。但是這些方法實際操作起來卻常常存在較大難度。因此，尋找一種快速簡便判斷小分子的在果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)結合位點的方法是急需解決的問題。

發明內容

本發明針對現有技術中存在的不足，目的在于提供一種用于快速判斷小分子結合人體肝臟果糖1,6-二磷酸酶底物位點或變構位點的方法。

為實現上述發明目的，本發明所采用的技術方案為：

一種用于快速判斷小分子結合人體肝臟果糖1,6-二磷酸酶底物位點或變構位點的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)采用氨基酸定點突變技術將果糖1,6-二磷酸酶的蛋白序列262位(底物位點)的苯丙氨酸(Phe)突變為色氨酸(Trp)，記為蛋白F262W；同理，采用氨基酸定點突變技術將果糖1,6-二磷酸酶的蛋白序列89位(變構位點)的苯丙氨酸(Phe)突變為色氨酸(Trp)，記為蛋白F89W；(2)將小分子與蛋白F262W結合，在不同溫度下，利用熒光分光光度計檢測小分子和蛋白F262W結合時的熒光猝滅過程，經數據處理后得到不同溫度下小分子和蛋白F262W結合時的熒光猝滅常數，記為K_SV；同理，將小分子與蛋白F89W結合，在不同溫度下，利用熒光分光光度計檢測小分子和蛋白F89W結合時的熒光猝滅過程，經數據處理后得到不同溫度下小分子與蛋白F89W結合時的熒光猝滅常數，記為K’_SV；

(3)利用熒光猝滅常數K_SV和K’_SV進行結果判定：