[發明專利]一種用于快速判斷小分子結合人體肝臟果糖1;6-二磷酸酶底物位點或變構位點的方法

有效

• 申請號: 201611270093.5
• 申請日: 2016-12-30
• 公開（公告）號: CN106770122B
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發明（設計）人: 萬堅;黃運遠;徐榕;韓新亞;肖閃;任彥亮;馮玲玲;饒立
• 申請（專利權）人: 華中師范大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 喬宇;徐曉琴

1.一種用于快速判斷小分子結合人體肝臟果糖1,6-二磷酸酶底物位點或變構位點的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)采用氨基酸定點突變技術將果糖1,6-二磷酸酶的蛋白序列262位(底物位點)的苯丙氨酸突變為色氨酸，記為蛋白F262W；同理，采用氨基酸定點突變技術將果糖1,6-二磷酸酶的蛋白序列89位(變構位點)的苯丙氨酸突變為色氨酸，記為蛋白F89W；

(2)將小分子與蛋白F262W結合，在不同溫度下，利用熒光分光光度計檢測小分子和蛋白F262W結合時的熒光猝滅過程，經數據處理后得到不同溫度下小分子和蛋白F262W結合時的熒光猝滅常數，記為K_SV；同理，將小分子與蛋白F89W結合，在不同溫度下，利用熒光分光光度計檢測小分子和蛋白F89W結合時的熒光猝滅過程，經數據處理后得到不同溫度下小分子與蛋白F89W結合時的熒光猝滅常數，記為K’_SV；

(3)利用熒光猝滅常數K_SV和K’_SV進行結果判定：

a.若蛋白F262W熒光猝滅且Ksv隨著溫度的升高而降低，則表明小分子結合在果糖1,6-二磷酸酶的底物位點上；反之，若蛋白F262W未熒光猝滅或Ksv隨著溫度的升高而升高，則表明小分子未結合在果糖1,6-二磷酸酶的底物位點上；

b.若蛋白F89W熒光猝滅且K’_SV隨著溫度的升高而降低，則表明小分子結合在果糖1,6-二磷酸酶的變構位點上；反之，若蛋白F89W未熒光猝滅或K’_SV隨著溫度的升高而升高，則表明小分子未結合在果糖1,6-二磷酸酶的變構位點上。

2.根據權利要求1所述用于快速判斷小分子結合人體肝臟果糖1,6-二磷酸酶底物位點或變構位點的方法，其特征在于，所述熒光分光光度計檢測熒光猝滅過程的測試體系為：0.8mM Mg²⁺，50mM Tris-HCl，0.15mg/mL蛋白F262W或蛋白F89W，pH 7.4，體系總體積為1mL。

3.根據權利要求1所述用于快速判斷小分子結合人體肝臟果糖1,6-二磷酸酶底物位點或變構位點的方法，其特征在于，所述熒光分光光度計的設置為激發波長為280nM，發射波長設為285～400nM，狹縫長度為5nm，平滑因子為7，電壓為710V。

4.根據權利要求1所述用于快速判斷小分子結合人體肝臟果糖1,6-二磷酸酶底物位點或變構位點的方法，其特征在于，利用Stern-Vlomer方程對數據進行處理得到熒光猝滅常數，所述Stern-Vlomer方程為其中F₀為不加小分子時波峰最高點的熒光強度，F為加入小分子后波峰最高點的熒光強度，Q為小分子濃度。

5.根據權利要求1所述用于快速判斷小分子結合人體肝臟果糖1,6-二磷酸酶底物位點或變構位點的方法，其特征在于，檢測301K～310K溫度下的熒光猝滅常數用于判定熒光猝滅常數隨溫度的變化情況。