[發明專利]一種花生四烯酸的微生物發酵方法

在審

• 申請號: 201611268294.1
• 申請日: 2016-12-31
• 公開（公告）號: CN106834137A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 崔悅;劉廣寧
• 申請（專利權）人: 新昌縣迪斯曼科技有限公司
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12P7/64;C12R1/645
• 代理公司: 北京高航知識產權代理有限公司11530
• 代理人: 趙永強

技術領域

本發明涉及一種花生四烯酸的微生物發酵方法，屬于微生物發酵領域。

背景技術

花生四烯酸，是全順式-5，8，11，14-二十碳四烯酸，屬于不飽和脂肪酸，其中含有四個碳-碳雙鍵，一個碳-氧雙鍵，為高級不飽和脂肪酸。廣泛分布于動物界，少量存在于某個種的甘油酯中，也能在甘油磷脂類中找到。人體內可由亞油酸合成。推斷它是前列腺素生物合成的起始物之一。

花生四烯酸(Arachidonicacid)即全順5，8，11，14二十碳四烯酸，它是一種多價不飽和脂肪酸，也被稱為5，8，11，14-花生酸，簡稱ARA或AA。

花生四烯酸是一種重要的人體必需脂肪酸，在體內不能自身合成，必須由食物供給，是人體前列腺素合成的重要前體物質，也是人體中含量最高，分布最廣的一種多不飽和脂肪酸，主要存在于器官肌肉和血液組織中，與磷脂結合成結構脂類起著重要作用。花生四烯酸在調節心臟興奮性、參與神經內分泌、促進細胞分裂、抑制血小板凝集、抗炎癥、抗癌、抗脂質氧化、促進腦組織發育和保護視力等方面具有獨特的生物活性，被廣泛應用于食品、化妝品、飼料及其添加劑、嬰兒配方奶粉、生物制藥等領域。花生四烯酸廣泛存在于動物體中，主要來源于動物的腎上腺、肝臟以及沙丁魚、雞蛋黃等，但含量較低，一般低于0.2%(wt/wt)。

因人體內的花生四烯酸主要靠從外界攝取，所以加強對花生四烯酸的研究與開發具有十分重要的作用。目前人們主要利用微生物發酵法獲得花生四烯酸，而種子的擴大培養是發酵生產的關鍵步驟，母種質量的優劣對生產質量和產量起著至關重要的作用，但現有技術中生產花生四烯酸油脂的大多數母種都是采用液體發酵培養法，獲得的產品中仍然存在著油脂中花生四烯酸含量偏低、微生物生長周期長、培養工藝未達到最優化或發酵所采用的培養基成本高等問題，限制了花生四烯酸的大規模工業化生產。

發明內容

本發明的目的在于提供一種花生四烯酸的微生物發酵方法，它摒棄傳統的液體發酵培養方法，采用固料培養花生四烯酸母種，所獲菌種細胞的生長活力強、同步性較好、生理狀態穩定，移種至發酵罐后能迅速生長，縮短延遲期，并能保持穩定的產品收得率。

本發明是這樣實現的，所述的一種花生四烯酸的微生物發酵方法，其固體培養基由以下原料組成：牛肉膏蛋白胨、酵母粉、麥芽糖、維生素A、維生素K、氯化鈉、甲氧基肉桂酸辛酯、小麥粉。

具體的，由以下原料及其重量份數組成，每100g培養基中含有：牛肉膏蛋白胨30-50g、酵母粉5-10g、麥芽糖20-25g、維生素A0.5-1g、維生素K0.25-0.5g、氯化鈉1.2g、甲氧基肉桂酸辛酯0.5-0.8g、小麥粉補足。甲氧基肉桂酸辛酯在培養基中能提高培養基的生產效率，增強菌種活性，防止培養基老化。

發酵培養基由以下原料組成：麥芽糖、牛肉膏蛋白胨、酵母粉、硝酸鈉、氯化鉀、十二水合硫酸氫鉀、維生素B₁₂、維生素K、碳酸氫鈉、水。

具體的，上述發酵培養基由以下原料及其重量份數組成，每100g培養基中含有：麥芽糖10-15g、牛肉膏蛋白胨30-50g、酵母粉10-15g、硝酸鈉1-3g、氯化鉀1-2g、十二水合硫酸氫鉀0.5-1g、維生素B₁₂0.25-0.5g、維生素K0.1-0.2g、碳酸氫鈉1-2g、水補足。

本發明還提供了一種花生四烯酸的微生物發酵方法的具體步驟，如下所述：

（1）產花生四烯酸普通被孢霉發酵固料種子培養

（ⅰ）菌種活化：采用斜面菌種活化，試管斜面培養基為PDA固體培養基，將產花生四烯酸的普通被孢霉菌種接于PDA斜面，24-26℃培養2-3天。

（ⅱ）固料種子培養基的制備：將上述固體培養基配料按比例混合，，80-100℃蒸煮20-30min，晾干至散開不結團，按200g/瓶分裝進規格為1000mL的K氏瓶中，121℃滅菌30min。

（ⅲ）固料種子的培養：將新鮮斜面菌種加15-25mL無菌水洗下孢子，制成孢子懸液，倒入已滅菌固料培養基，輕搖使其盡量混勻，并于24-26℃培養2-3天，分別于12h和24h各搖勻一次，作為一級發酵的母種。

（2）發酵培養

（ⅰ）發酵培養基的制備，將上述發酵培養基各組分混合調節pH為5.8-6.0,121℃滅菌30min。

（ⅱ）搖瓶發酵培養，即小樣發酵培養