[發明專利]一種花生四烯酸的微生物發酵方法

在審

• 申請號: 201611268294.1
• 申請日: 2016-12-31
• 公開（公告）號: CN106834137A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 崔悅;劉廣寧
• 申請（專利權）人: 新昌縣迪斯曼科技有限公司
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12P7/64;C12R1/645
• 代理公司: 北京高航知識產權代理有限公司11530
• 代理人: 趙永強

1.一種花生四烯酸的微生物發酵方法，其特征在于固體培養基由以下原料組成：牛肉膏蛋白胨、酵母粉、麥芽糖、維生素A、維生素K、氯化鈉、甲氧基肉桂酸辛酯、小麥粉。

2.根據權利要求1所述的一種花生四烯酸的微生物發酵方法，其特征在于固體培養基由以下原料及其重量份數組成，每100g培養基中含有：牛肉膏蛋白胨30-50g、酵母粉5-10g、麥芽糖20-25g、維生素A0.5-1g、維生素K0.25-0.5g、氯化鈉1.2g、甲氧基肉桂酸辛酯0.5-0.8g、小麥粉補足。

3.根據權利要求1所述的一種花生四烯酸的微生物發酵方法，其特征在于發酵培養基由以下原料組成：麥芽糖、牛肉膏蛋白胨、酵母粉、硝酸鈉、氯化鉀、十二水合硫酸氫鉀、維生素B₁₂、維生素K、碳酸氫鈉、水。

4.根據權利要求3所述的一種花生四烯酸的微生物發酵方法，其特征在于發酵培養基由以下原料及其重量份數組成，每100g培養基中含有：麥芽糖10-15g、牛肉膏蛋白胨30-50g、酵母粉10-15g、硝酸鈉1-3g、氯化鉀1-2g、十二水合硫酸氫鉀0.5-1g、維生素B₁₂0.25-0.5g、維生素K0.1-0.2g、碳酸氫鈉1-2g、水補足。

5.根據權利要求1所述的一種花生四烯酸的微生物發酵方法，其特征在于具體步驟，如下所述：

1）產花生四烯酸普通被孢霉發酵固料種子培養

ⅰ）菌種活化：采用斜面菌種活化，試管斜面培養基為PDA固體培養基，將產花生四烯酸的普通被孢霉菌種接于PDA斜面，24-26℃培養2-3天。

ⅱ）固料種子培養基的制備：將上述固體培養基配料按比例混合，80-100℃蒸煮20-30min，晾干至散開不結團，按200g/瓶分裝進規格為1000mL的K氏瓶中，121℃滅菌30min。

ⅲ）固料種子的培養：將新鮮斜面菌種加15-25mL無菌水洗下孢子，制成孢子懸液，倒入已滅菌固料培養基，輕搖使其盡量混勻，并于24-26℃培養2-3天，分別于12h和24h各搖勻一次，作為一級發酵的母種。

2）發酵培養

ⅰ）發酵培養基的制備，將上述發酵培養基各組分混合調節pH為5.8-6.0，121℃滅菌30min。

ⅱ）搖瓶發酵培養，即小樣發酵培養

以200-300ml無菌水洗下上述固料種子表面的孢子，制成孢子懸液，按體積百分比為5-10%接種量接入搖瓶發酵培養基，培養溫度為26-30℃，搖床轉速150-200r/min，培養3-5天；發酵結束后收集濕菌體，烘干后提取干菌體中的油脂進行氣相色譜檢測，檢測花生四烯酸收得率。

ⅲ）發酵罐發酵培養，即中樣發酵培養：以200-300ml無菌水洗下上述固料種子表面的孢子，制成孢子懸液，按體積百分比為5-10%接種量接入一級發酵罐，發酵溫度為26-30℃，培養1.5-2.5天；一級發酵至二級發酵的接種量體積百分比為10-20%，發酵溫度前期控制在26-30℃，促進菌體生長，后期為促進花生四烯酸油脂合成，將溫度下調至18-20℃，培養周期為3-4.5天；為保證菌體生長和合成油脂的需要，整個發酵過程除自動流加經118℃滅菌25min的重量百分比為40%葡萄糖溶液，以及重量百分比為28%氨水用于控制還原糖在前40h為6-8g/L、40h之后為3-8g/L以及pH為5.8-6.0外，另外進行2次手動補加輔料，補加輔料時間分別為發酵36h和69h，輔料分別由葡萄糖、大豆餅粉、玉米漿粉、橄欖油、磷酸氫二鉀及各類微量元素組成，微量元素可以是維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12、煙酸、煙酸胺、泛酸鈣、葉酸、生物素、葉綠素中的一種或幾種的組合；發酵結束后收集濕菌體，烘干后提取干菌體中的油脂進行氣相色譜檢測，檢測花生四烯酸收得率。