[發明專利]一種適用檢測辛硫磷殘留分析的ELISA檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201611267741.1
• 申請日: 2016-12-31
• 公開（公告）號: CN106841589A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 馬列;紀明山;魏松紅;閆恕;姜震
• 申請（專利權）人: 沈陽金誠科技有限公司
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/532
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責任公司21101
• 代理人: 張述學

技術領域

本發明涉及一種蔬菜水果農藥殘留檢測技術，特別是一種適用檢測辛硫磷殘留分析的ELISA檢測試劑盒及檢測方法，能快速測定大批量蔬菜、水、土壤、中毒等環境等樣品中的辛硫磷殘留。

背景技術

色譜(HPLC)、質譜(MS)等物理化學分析手段，但由于農藥使用規模不斷擴大，農藥殘留造成環境影響和人類健康的慢性和長期效應日益受到人們關注和擔憂，對農藥殘留的限制也越來越嚴格，對分析測定對象、種類、數量、范圍、指標等諸方面都提出了新的要求和更高的標準，但傳統的理化分析方法通常繁瑣復雜，樣品前處理過程復雜，工作量大，儀器昂貴，并要求有熟練的技術人員及較長的分析周期。因此人們迫切希望有一種簡單，快速，靈敏及廉價的檢測技術能在野外和實驗室內進行大批量的篩選試驗。免疫分析法正具備這些優點，所以盡管免疫分析用于農藥殘留分析的時間很短，但已很快用于環境樣品和食品中農藥殘留的分析。

辛硫磷作為有機磷類殺蟲劑的一種, 主要作用于乙酰膽堿酯酶。適合于防治地下害蟲對為害花生、小麥、水稻、棉花、玉米、果樹、蔬菜、桑、茶等作物的多種鱗翅目害蟲的幼蟲有良好的作用效果, 對蟲卵也有一定的殺傷作用, 也適于防治倉庫和衛生害蟲蒼蠅等。辛硫磷在糧食中最高允許殘留量應為0.25ppm。

目前對于辛硫磷殘留的檢測方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、膽堿酯酶抑制法、熒光法等。但這些方法都存在回收率低、檢測樣品前處理程序繁瑣、檢測周期長等缺點。因此，迫切需要一種快速簡便的新方法來檢測辛硫磷。酶聯免疫法（ELISA）是一種敏感、快速且效率極高的檢測分析方法與傳統的檢測方法相比，其具有樣品處理簡單、檢測速度快、方法簡便等優點。

發明內容

本發明的目的是提供一種適用檢測辛硫磷殘留分析的ELISA檢測試劑盒及檢測方法，具有高特異性、高靈敏度、高準確度、高精確度、操作方法簡單快速，并能用于大批量樣品快速檢測。

本發明提供一種辛硫磷人工抗體的制備方法：

(1)取辛硫磷，1,3-丙二胺，催化量的4-二甲氨基吡啶溶解于N,N-二甲基甲酞胺中，得到a液；

(2)取N, N-二環己基碳二亞胺溶解于DMF中，得到b液；

(3)在0℃條件下，將b液緩慢滴加至a液中，恢復室溫后，繼續反應20 h ；

(4)蒸除溶劑，柱層析(洗脫液:二氯甲烷/甲醇，體積比20 :1)，得到辛硫磷半抗原；免疫原制備-辛硫磷半抗原與牛血清白蛋白偶聯得到免疫原；

(5)取辛硫磷半抗原用DMF溶解，得到a液；

(6)取BSA 用磷酸鹽緩沖液溶解，得到b液；

(7)取碳化二酰亞胺(EDC)用磷酸鹽緩沖液溶解，得到工b液；

(8)將a液與b液混合，在攪拌下緩慢滴加入工b液，室溫反應2小時，4℃透析二天，每天換液三次，得到免疫原；

取辛硫磷人工抗原對新西蘭白兔進行免疫，免疫后取血，并測定其抗血清效價，直到其效價達到一定數值，即得到辛硫磷多克隆抗體將制備好的多克隆抗體保存于-20 ℃備用。

一種檢測辛硫磷的ELISA檢測試劑盒，包括盒體、設在盒體內的96孔/40孔酶標板和設在盒體內的試劑，其特征在于，在酶標板的每孔內，由包被液包被能與抗辛硫磷抗體特異性結合反應的包被抗原，盒內試劑包含洗滌液、底物稀釋液、辛硫磷標準溶液、抗辛硫磷抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗兔抗體、底物、顯色物質和反應終止液。

利用辛硫磷ELISA檢測試劑盒的檢測方法：

取出包被有辛硫磷包被抗原酶標板，恢復到室溫后備用；加入標樣或處理好的樣品到各自孔中，標樣和樣品做2~4個重復;加入抗體，孵育；倒出孔中的液體，將微孔板倒置在吸水紙上拍打，以保證完全除去孔中的液體，用200μL稀釋好的磷酸緩沖液(PBST)洗滌；加入酶標二抗，孵育；倒出孔中的液體，將微孔板倒置在吸水紙上拍打，以保證完全除去孔中的液體，用PBST洗滌；底物溶于底物溶液后，加入過氧化氫，然后每孔加入顯色液，輕微振勻，孵育；加入反應終止液，混合好后，測定OD₄₉₀值。

以所獲得的標樣和樣品吸光值的平均值計算各孔的吸光值的抑制率

抑制率(%)=抑制率(%)=[ (ODmax-ODmin)-(ODx-ODmin)]/(ODmax-ODmin)×100%

其中：ODmax、為不加藥時的吸光值，ODx為農藥x時的吸光值，ODmin為空白對照孔的吸光值