[發明專利]一種適用檢測辛硫磷殘留分析的ELISA檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201611267741.1
• 申請日: 2016-12-31
• 公開（公告）號: CN106841589A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 馬列;紀明山;魏松紅;閆恕;姜震
• 申請（專利權）人: 沈陽金誠科技有限公司
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/532
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責任公司21101
• 代理人: 張述學

1.一種辛硫磷多克隆抗體的制備方法，主要包括如下步驟:

（1）取20 mg辛硫磷，10ul，1,3-丙二胺，適量的4-二甲氨基吡啶溶解于2mL N, N-二甲基甲酰胺中，得a液；

（2）取20mg N, N-二環己基碳二亞胺溶解于0. 5m1N, N-二甲基甲酰胺中，得到b液；

（3）在0℃條件下，將b液緩慢滴加至a液中，恢復室溫后，繼續反應20 h ；

（4）蒸除溶劑，柱層析：洗脫液為二氯甲烷/甲醇，兩者體積比20 :1，得到辛硫磷半抗原；

（5）將半抗原與載體蛋白進行偶聯，得到辛硫磷人工抗原；

（6）利用辛硫磷人工抗原對小型哺乳動物進行免疫，所得到的多克隆抗體即為辛硫磷克隆抗體。

2.一種辛硫磷殘留分析的酶聯免疫吸附測定試劑盒，其特征在于：該試劑盒體內包括有包被辛硫磷抗原的酶標板，洗滌液、辛硫磷標準品、辛硫磷抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗兔抗體、底物顯色液和反應終止液。

3.根據權利要求2所述的辛硫磷殘留分析的酶聯免疫吸附測定試劑盒，其特征在于：洗滌液：Na₂HPO₄·12H2O 68.8 g，NaH₂PO₄ 6.9 g，NaCl 45 g；

底物顯色液為TMB-過氧化氫脲溶液，配制步驟如下：底物液A：取無水乙酸鈉8.2 g，β-糊精2.5 g，過氧化氫脲428.6 mg，加雙蒸水至1000 mL，調節PH至5.0，4℃保存；底物液B：取100 mg TMB溶于10 mL DMSO中，棕色瓶保存；使用前取14.6 mL底物液A和0.45 mL底物液B混合15 min；

反應終止液為1.25mol/L的H₂SO₄。

4.一種利用權利要求2或3所述試劑盒檢測樣品中辛硫磷殘留的方法，包括以下步驟：

（1）樣品前處理：稱取果蔬中可食用部分10 g放入研缽中，加入取10 mL提取液，充分研磨并過濾，所得濾液經處理后即為待測樣品；

（2）在包被有辛硫磷抗原并封閉好的酶標板孔中，加入相同體積的辛硫磷及待測樣品，37 ℃孵育40 min后用洗滌液洗滌，靜置5min，甩掉洗液，將酶標板拍干，洗滌3次；

（3）加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔抗體0.1 mL，37 ℃孵育40min后用洗滌液，靜置5min，甩掉洗液，將酶標板拍干，洗滌3次；

（4）加入新鮮配制的底酶標板物顯色液，每孔0.1 mL，37 ℃反應30min，觀察顏色變化；

（5）待顯色反應結束后，加入終止液，每孔0.05 mL，終止反應；

（6）將酶標板置于酶標儀中，于490 nm波長處測定檢測結果。