[發(fā)明專利]巖黃連愈傷組織高效誘導(dǎo)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611264732.7
• 申請(qǐng)日: 2016-12-30
• 公開（公告）號(hào): CN106718923A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李翠;張占江;王一諾;韋瑩;郭曉云;韋坤華;李林軒
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)藥用植物園
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 北京遠(yuǎn)大卓悅知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11369
• 代理人: 靳浩

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種巖黃連愈傷組織高效誘導(dǎo)方法。

背景技術(shù)

巖黃連,為罌粟科植物巖黃連(Euphorbia pekinensis Rupr.)，多年生常綠草本，根為圓柱狀，長20-30厘米，花期5-8月，果期6-9月。巖黃連廣布于全國(除臺(tái)灣、云南、西藏和新疆)，北方尤為普遍，生于山坡、灌叢、路旁、荒地、草叢、林緣和疏林內(nèi)。巖黃連根可入藥，具有較高的藥用價(jià)值，具有逐水通便，消腫散結(jié)，主治水腫，并有通經(jīng)之效，用于治療慢性腎炎，治療晚期血吸蟲病腹水或其他肝硬變腹水等癥。近年來其資源遭到了嚴(yán)重破壞，且對(duì)生長環(huán)境要求苛刻，隨著市場需求量的不斷增加，野生巖黃連資源瀕臨枯竭了，生產(chǎn)上難以實(shí)現(xiàn)大面積栽培。如何保護(hù)野生巖黃連資源并讓其大量繁殖是目前急需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是解決野生巖黃連難以大面積繁殖的問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點(diǎn)。

為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種巖黃連愈傷組織高效誘導(dǎo)方法，取巖黃連外植體經(jīng)洗凈消毒后接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)10-15天得到愈傷組織，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還加入6-芐基腺嘌呤0.5-1.5mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.5-1.5mg/L、維生素C 5-20mg/L、活性炭0.1-0.3g/L、蔗糖20-30g/L以及瓊脂3.8-4.5g/L，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值為6.0。

優(yōu)選的是，將所述愈傷組織接種至增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，所述增殖培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，還添加6-芐基腺嘌呤0.1-1.0mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.2-1.0mg/L、維生素C5-20mg/L、活性炭0.1-0.3g/L、蔗糖20-30g/L以及瓊脂3.8-4.5g/L，所述增殖培養(yǎng)基的pH值為5.8。

優(yōu)選的是，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的具體步驟為：將消毒后的所述巖黃連外植體放于溫度為23-26℃下，先暗培養(yǎng)1周后，再置于的光照時(shí)間為10-12h/d，光照強(qiáng)度1400-2000lux 的條件下培養(yǎng)3-8天。

優(yōu)選的是，所述增殖培養(yǎng)的條件為：培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1400-2000lux，光照強(qiáng)度為10-12h/d。

優(yōu)選的是，所述巖黃連外植體洗凈消毒方法為：取巖黃連外植體依次用2％清洗劑水溶液浸泡5-10min、線狀自來水沖洗5-15min、質(zhì)量濃度為75％乙醇表面消毒30-45s、質(zhì)量濃度為0.1％HgCl₂消毒8-10min、無菌水沖洗3-5次，最后用消毒濾紙吸去表面水分，備用。

優(yōu)選的是，所述巖黃連外植體為葉片、葉柄，莖中的一種。

優(yōu)選的是，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中還加入有水楊酸0.59-0.88mg/L、茉莉酸甲酯0.42-0.79mg/L、精氨酸0.4-1g/L、L-半胱氨酸0.2-0.8g/L以及賴氨酸0.1-0.6g/L。

優(yōu)選的是，所述增殖培養(yǎng)基中還加入油菜素內(nèi)酯0.04-0.08mg/L、硼氫化鉀7-12mg/L、硫酸亞鐵3-6mg/L以及葉酸0.4-0.8mg/L。

本發(fā)明至少包括以下有益效果：

(1)6-芐基腺嘌呤一般在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)外植體出芽，本發(fā)明加入2,4-二氯苯氧乙酸，可以協(xié)同6-芐基腺嘌呤加快出芽速度，在愈傷組織增殖過程中，一般用2,4-二氯苯氧乙酸誘導(dǎo)增殖，本發(fā)明在增殖培養(yǎng)基中加入6-芐基腺嘌呤，協(xié)同2,4-二氯苯氧乙酸誘導(dǎo)愈傷組織快速增殖，本發(fā)明可以高效誘導(dǎo)出愈傷組織且能使得愈傷組織快速增殖，從而解決野生巖黃連難以大面積繁殖的問題；

(2)本發(fā)明在誘導(dǎo)培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基中均加入VC，可以防止外植體出芽和愈傷組織發(fā)生褐化；

(3)本發(fā)明在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入水楊酸，水楊酸不但可以起到殺菌的作用還能促進(jìn)芽的生長，茉莉酸甲酯可促進(jìn)外植體在誘導(dǎo)過程中基因的表達(dá)，進(jìn)而加快誘導(dǎo)過程，精氨酸、L-半胱氨酸以及賴氨酸的加入不但為外植體在誘導(dǎo)過程中提供了營養(yǎng)，而且精氨酸可以促進(jìn)外植體細(xì)胞分裂，L-半胱氨酸是一種還原劑，可以進(jìn)一步防止組織褐化，賴氨酸能夠促進(jìn)芽的生長發(fā)育，加快愈傷組織的形成；