[發明專利]用于血漿ctDNA非特異復制的試劑盒

有效

• 申請號: 201611259957.3
• 申請日: 2016-12-30
• 公開（公告）號: CN108265046B
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發明（設計）人: 張介中;姜鋒;杜洋;玄兆伶;李大為;梁峻彬;陳重建
• 申請（專利權）人: 浙江安諾優達生物科技有限公司;安諾優達基因科技（北京）有限公司;安諾優達（義烏）醫學檢驗有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于血漿ctDNA非特異性復制的方法，其使用試劑盒實施，

所述試劑盒包括：

用于加接頭的試劑，所述用于加接頭的試劑包括接頭；

用于PCR擴增的試劑，所述用于PCR擴增的試劑包括3'末端有dU標記的引物和KAPAHiFi Uracil+聚合酶體系；

用于切割的試劑，所述用于切割的試劑包括具有dU切割功能的酶和單鏈特異性切割功能的酶，

所述3'末端有dU標記的引物為核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的單鏈DNA與核苷酸序列如SEQ ID NO： 4所示的單鏈DNA，

SEQ ID NO：3：5'- GCACTAGGCTACACGACGATCTAACTAGCU-3'，

SEQ ID NO：4：5'- CAGTGGTCAGACGTGGAATCTAACTAGCU-3'，

所述方法包括：

步驟A：將血漿ctDNA片段進行加接頭，得到加接頭DNA片段；

步驟B：使用在3'末端有dU標記的引物對所述加接頭的DNA片段進行PCR擴增，得到帶有dU標記的PCR產物；

步驟C：使用具有dU切割功能的酶切除PCR產物中的dU，得到具有缺刻的DNA片段；以及

步驟D：使用具有單鏈特異性切割功能的酶酶切具有缺刻的DNA片段，得到與血漿ctDNA片段基本相同的可利用DNA片段。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述接頭為核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的單鏈DNA與核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的單鏈DNA的退火產物，

SEQ ID NO：1：5'- GCTAGTTAGATCGTCGTGTAGCCTAGTGC-3'，

SEQ ID NO：2：5'- CAGTGGTCAGACGTGGAATCTAACTAGCT-3'。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述用于加接頭的試劑還包括選自下組中的至少一種：T4 DNA連接酶和T4 DNA連接酶緩沖液。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有dU切割功能的酶為EndonucleaseⅧ和UDG混合物。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有單鏈特異性切割功能的酶為綠豆核酸酶和/或S1核酸酶。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切的試劑還包括選自下組中的至少一種： Endonuclease Ⅷ緩沖液及UDG緩沖液、綠豆核酸酶緩沖液以及SI核酸酶緩沖液。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述試劑盒還包括：用于末端修復的試劑和/或用于3'端加A的試劑，

所述用于末端修飾的試劑包括選自下組中的至少一種或兩種以上： T4 DNA 聚合酶、T4 多聚核苷酸激酶、Klenow 片段、Klenow緩沖液以及T4 多聚核苷酸激酶緩沖液；

所述用于3'端加A的試劑包括選自下組中的至少一種：Klenow片段（3'-5'exo-）和Klenow緩沖液。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，將步驟A中的血漿ctDNA片段先進行末端修復和/或3'端加A，再進行加接頭。