[發明專利]用于血漿ctDNA非特異復制的試劑盒

有效

• 申請號: 201611259957.3
• 申請日: 2016-12-30
• 公開（公告）號: CN108265046B
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發明（設計）人: 張介中;姜鋒;杜洋;玄兆伶;李大為;梁峻彬;陳重建
• 申請（專利權）人: 浙江安諾優達生物科技有限公司;安諾優達基因科技（北京）有限公司;安諾優達（義烏）醫學檢驗有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種用于血漿ctDNA非特異性復制的試劑盒。本發明的試劑盒包括用于加接頭的試劑、用于PCR擴增的試劑、用于切割的試劑。應用本發明的試劑盒進行血漿ctDNA復制具有以下優點：獲得大量與血漿ctDNA基本相同的可利用DNA片段。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種用于血漿ctDNA非特異性復制的試劑盒。

背景技術

腫瘤細胞會向血液中釋放基因組DNA，這些變異DNA也隨之釋放到外周血中，被稱為循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)。研究發現，ctDNA在早期原位癌(primarycancer)患者血液中就已經開始出現。由于外周血循環DNA半衰期短，因此循環腫瘤DNA能夠真實反映患者病變組織基因突變的真實情況。另有文獻報道，癌變人群血漿中游離100～400bp大小的DNA片段濃度明顯高于正常人，可以作為篩查的標志物。

但其含量極少，在提取過程中容易丟失，提取難度大，提取量較少，難以滿足常規檢測或研究的要求，如何獲得足量的ctDNA片段，是針對此類DNA進行研究及檢測急需解決的問題。

發明內容

鑒于上述現有技術中存在的問題，本發明的目的在于提供一種用于血漿ctDNA非特異復制的試劑盒，用于可以對血漿中的ctDNA進行有效復制，可獲得大量與游離ctDNA序列基本相同DNA片段。

本發明為解決上述問題進行了深入研究，結果發現：使用具有dU標記的引物對加接頭的DNA片段進行PCR擴增，使用具有dU堿基切割功能的酶及具有單鏈特異性切割功能的酶對PCR擴增產物進行酶切，可完全切除接頭序列，獲得大量與與進行血漿ctDNA片段基本相同的DNA片段。

即，本發明包括：

1.一種用于血漿ctDNA非特異性復制的試劑盒，其中，包括：

用于加接頭的試劑，所述用于加接頭的試劑包括接頭；

用于PCR擴增的試劑，所述用于PCR擴增的試劑包括3'端有dU標記的引物；

用于切割的試劑，所述用于切割的試劑包括具有dU切割功能的酶和單鏈特異性切割功能的酶。

2.根據項1所述的試劑盒，其中，所述接頭為核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的單鏈DNA與核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的單鏈DNA的退火產物，

SEQ ID NO：1：5'-GCTAGTTAGATCGTCGTGTAGCCTAGTGC-3'，

SEQ ID NO：2：5'-CAGTGGTCAGACGTGGAATCTAACTAGCT-3'。

3.根據項1～2任一項所述的試劑盒，其中，所述3'端dU標記的引物為核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的單鏈DNA與核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的單鏈DNA，

SEQ ID NO：3：5'-GCACTAGGCTACACGACGATCTAACTAGCU-3'，

SEQ ID NO：4：5'-CAGTGGTCAGACGTGGAATCTAACTAGCU-3'。

4.根據項1～3任一項所述的試劑盒，其中，所述用于加接頭的試劑還包括選自下組中的至少一種：T4DNA連接酶和T4DNA連接酶緩沖液。

5.根據項1～4任一項所述的試劑盒，其中，所述具有dU切割功能的酶為EndonucleaseⅧ和UDG的混合物。

6.根據項1～5任一項所述的試劑盒，其中，所述具有單鏈特異性切割功能的酶為綠豆核酸酶和/或S1核酸酶。