[發明專利]CRISPR/Cas9靶向敲除人乙肝病毒P基因及其特異性gRNA

有效

• 申請號: 201611259587.3
• 申請日: 2016-12-30
• 公開（公告）號: CN106701763B
• 公開（公告）日: 2019-07-19
• 發明（設計）人: 周勇;申友鋒
• 申請（專利權）人: 重慶高圣生物醫藥有限責任公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明屬于基因工程技術領域，更具體地說，本發明涉及基于CRISPR/Cas9系統的向導RNA（gRNA）序列及其組合在用于特異性靶向敲除乙型肝炎病毒cccDNA P基因的gRNA。本發明根據CRISPR/Cas9的設計原則，設計了30個gRNA，其序列表見SEQ ID NO.1?30所示，并且將其構建在PX458載體上，篩選出4個最高效率的gRNA。在人肝癌細胞株(HepG2.2.15)中利用這4條gRNA及其組合指導的CRISPR/Cas9系統，可以有效的敲除人乙型肝炎病毒cccDNA P基因。利用本發明制備的特異性靶向乙型肝炎病毒cccDNA的gRNA能夠精確靶向乙型肝炎病毒cccDNA并且實現基因敲除。該制備方法操作簡單、gRNA靶向性好，CRISPR/Cas9系統的敲除效率高。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及CRISPR/Cas9特異性敲除人乙肝病毒P基因的方法以及用于特異性靶向人乙肝病毒P基因的gRNA。

背景技術

乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV）是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科，HBV能夠引發慢性肝炎、急性肝炎、肝硬化、肝癌等疾病。HBV是世界范圍性的流行性疾病，全球約有3.5～4億人感染慢性HBV，在我國，HBV的感染率高達60%~70%，有9300萬人攜帶乙肝病毒，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬例。乙型肝炎治療的目的是減輕肝臟病變，防止或延緩發展為肝硬化、肝癌，最終目標是徹底清除病毒，達到完全治愈。除一般的保護肝臟和免疫調節治療外，抗病毒治療是肝炎治療的重點也是難點。到目前臨床應用的抗HBV藥物有兩大類: 干擾素及核酸類似物，由于HBV易突變，耐藥突變株在不斷的出現，使得現有的抗HBV藥物難以達到理想的治療效果。

HBV基因組結構高度濃縮，結構基因與調節基因之間重疊，甚至結構基因序列之間也相互重疊，有不同的變異株，但每個病毒株的L(-)鏈均含有4個開放讀碼框，分別是S、C、P、X區。其中P-ORF是HBVDNA序列中最長的ORF，編碼的P蛋白是對病毒生活周期起重要作用的多功能酶，參與病毒基因組復制的全過程，每一個結構域在基因組復制過程中都發揮不同的作用。由于P蛋白的重要性，使其成為抗病毒藥物的主要靶點。

CRISPR-Cas9系統已經成功應用于植物、細菌、酵母、魚類及哺乳動物細胞，是目前最高效的基因組編輯系統，具有的快速、簡便、高效、多位點、特異性靶向敲除基因的優勢，為高效靶向敲除HBV P-ORF，實現乙型肝炎及其相關疾病的治療提供了一種可能的選擇。本發明的目的就是要驗證利用CRISPR-Cas9 高效靶向敲除HBV P-ORF，提供相應的技術方案，達到特異性敲除HBV P-ORF的目的。

發明內容

本發明的目的在于通過設計、構建、篩選，最終提供一些基于CRISPR/Cas9系統，同時靶向人乙型肝炎病毒P基因的高效gRNA及其靶位點序列，并用其抑制人乙型肝炎病毒P基因的表達，從而抑制乙型肝炎病毒的增值。

為實現上述目的，本發明以CRISPR/Cas9系統原理及其gRNA的設計原理為基礎，軟件設計預測，設計出一系列的gRNA，并以PX458為表達載體，構建了gRNA/Cas9表達系統。通過篩選和一系列的分析測試，最終篩選出4個針對基因組靶點有效的gRNA，并在HepG2.2.15細胞模型中加以應用。

本申請的技術方案如下

1、靶向人乙型肝炎病毒P基因的高效gRNA及其靶點序列的設計及gRNA/Cas9表達系統構建；

2、在HepG2.2.15細胞模型中，分析檢測gRNA指導的CRISPR系統對于人乙肝病毒cccDNA靶位點敲除效率，篩選到8條較高效的gRNA；