[發明專利]CRISPR/Cas9靶向敲除人乙肝病毒P基因及其特異性gRNA

有效

• 申請號: 201611259587.3
• 申請日: 2016-12-30
• 公開（公告）號: CN106701763B
• 公開（公告）日: 2019-07-19
• 發明（設計）人: 周勇;申友鋒
• 申請（專利權）人: 重慶高圣生物醫藥有限責任公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.在CRISPR/Cas9特異性敲除乙型肝炎病毒cccDNA P基因中用于特異性靶向乙型肝炎病毒cccDNA P基因的gRNA，其特征在于，所述gRNA在乙型肝炎病毒cccDNA P基因上的靶向位點序列如序列表SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 11任意一條序列所述。

2.根據權利要求1所述的在CRISPR/Cas9特異性敲除乙型肝炎病毒cccDNA P基因中用于特異性靶向乙型肝炎病毒cccDNA P基因的gRNA，所述 gRNA 在乙型肝炎病毒cccDNA P基因的靶序列符合 5’- N (20)-NGG3’ 或者 5’-CCN- N (20)N-3’的序列排列規則，在乙型肝炎病毒cccDNA P基因上的靶序列是唯一的，其特征在于：所述 gRNA 在人乙型肝炎病毒P基因的靶向位點位于人乙型肝炎病毒P基因外顯子上。

3.根據權利要求1所述的在CRISPR/Cas9特異性敲除乙型肝炎病毒cccDNA P基因中用于特異性靶向乙型肝炎病毒cccDNA P基因的gRNA，其特征在于，所述gRNA在乙型肝炎治療中具有廣泛的應用前景。

4.CRISPR-Cas9 特異性敲除乙型肝炎病毒cccDNA P基因的方法，具體涉及如下步驟 ：

（1）根據權利要求 1-3 任意一項所述的 gRNA，在其對應DNA 序列的5’末端加上 CACC得到正向寡核苷酸序列，在其互補鏈的 5’末端加上 AAAC 得到反向寡核苷酸序列，分別合成正向和反向寡核苷酸序列，然后將合成的序列變性、退火，得到具有 BbsI 粘性末端的雙鏈 DNA 片段；

（2）將步驟（1）中合成的雙鏈 DNA 片段和用 BbsI 酶切過的PX458 載體進行連接，將連接產物轉化到大腸桿菌DH5a中，涂布于帶有氨芐青霉素抗性的LB平板上，篩選陽性菌落，提取陽性菌落質粒進行分析及測序，確定gRNA 表達載體構建成功，命名為PX458-gRNA-P1；

（3）將步驟（2）構建的gRNA載體轉染HepG2.2.15細胞，并用PX458空載體轉染HepG2.2.15 細胞作為對照組。