[發(fā)明專利]一種測(cè)定大鼠姜黃素血漿濃度的UHPLC?MS/MS分析方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611257300.3
• 申請(qǐng)日: 2016-12-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106841422A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-06-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 溫鼎聲;姜福林;陳江英;鐘國(guó)平;黃民
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州中大南沙科技創(chuàng)新產(chǎn)業(yè)園有限公司;中山大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/72;G01N30/88
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司44102
• 代理人: 陳衛(wèi)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于藥物動(dòng)力學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種測(cè)定大鼠姜黃素血漿濃度的UHPLC-MS/MS分析方法。

背景技術(shù)

姜黃素是從姜科、天南星科中的一些植物的根莖中提取的一種酚類色素，其中，姜黃約含3%～6%，是植物界很稀少的具有二酮的色素，為二酮類化合物。姜黃素為橙黃色結(jié)晶粉末，味稍苦，不溶于水。姜黃素具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、利膽、抗氧化等作用，是一種具有良好應(yīng)用前景的抗癌新藥。

藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)估是定量研究藥物在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄規(guī)律，并運(yùn)用數(shù)學(xué)原理和方法闡述血藥濃度隨時(shí)間變化的規(guī)律。隨著藥物化學(xué)的發(fā)展及人類健康水平的不斷提高，對(duì)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的要求越來(lái)越高：判斷一個(gè)藥物的應(yīng)用前景特別是市場(chǎng)前景，不單純是療效強(qiáng)，毒副作用小；更要具備良好的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。而藥物在血漿中濃度的檢測(cè)技術(shù)是藥代動(dòng)力學(xué)分析評(píng)估的重要前提技術(shù)。

目前，姜黃素血漿濃度的常用測(cè)定方法為：精密稱取姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品適量，加入1%羧甲基纖維素鈉溶液制得混懸液。取大鼠血漿置于肝素化的離心管中，5000r／min離心10min，吸取上清液置于另一離心管中，貯存于-20℃冰箱，備用。分別精密吸取0.2ml血漿樣品，加入0.5ml乙酸乙酯／氯仿（1:1），渦旋混勻即行萃取，12000r／min離心5min，離心后取上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中；再次加入0.5ml乙酸乙酯／氯仿（1:1），重新萃取1次，合并上清液，真空干燥，殘?jiān)?00μL甲醇溶解，過(guò)濾，取20μL進(jìn)樣。高效液相色譜（HPLC）色譜條件：流動(dòng)相，乙腈-水（含1%乙酸）=45:55；姜黃素：乙腈-水（含1%乙酸）=70:30；姜黃素檢測(cè)波長(zhǎng)：420nm；流速1.0mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：20μL；在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。該現(xiàn)有技術(shù)存在如下缺點(diǎn)：利用HPLC進(jìn)行大鼠姜黃素血漿濃度測(cè)定操作繁瑣，進(jìn)樣時(shí)間長(zhǎng)，定量下限不能滿足檢測(cè)要求等。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行的姜黃素血漿濃度的UHPLC-MS/MS分析方法，對(duì)姜黃素及其相關(guān)制劑在大鼠血漿內(nèi)的濃度進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，得到相應(yīng)的姜黃素色譜圖和離子質(zhì)譜圖，根據(jù)分析方法得到數(shù)據(jù)進(jìn)行姜黃素的藥動(dòng)學(xué)、生物等效性等一系列研究，能達(dá)到準(zhǔn)確有效地測(cè)定大鼠姜黃素血漿濃度的目的。

本發(fā)明的目的是提供一種測(cè)定大鼠姜黃素血漿濃度的UHPLC-MS/MS分析方法。

本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種測(cè)定大鼠姜黃素血漿濃度的UHPLC-MS/MS分析方法，包括如下步驟：

（1）配制姜黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液、內(nèi)標(biāo)替硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；

（2）待測(cè)血漿中加入內(nèi)標(biāo)后，進(jìn)行前處理，進(jìn)行LC-MS/MS分析，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)血漿中姜黃素的濃度。

具體優(yōu)選地，所述測(cè)定大鼠姜黃素血漿濃度的UHPLC-MS/MS分析方法，包括如下步驟：

S1.建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

S11.配制標(biāo)準(zhǔn)溶液：

精密稱取姜黃素對(duì)照品，溶解于乙腈溶液中震蕩搖勻，得1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再用甲醇/水=1/1稀釋液溶液梯度稀釋，得一系列濃度的姜黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液；

精密稱取替硝唑（Tinidazole）標(biāo)準(zhǔn)品，溶解于90%甲醇水溶液中震蕩搖勻，得1mg/mL的母液，再用90%甲醇水溶液稀釋成0.2 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液；

S12.建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別取一系列濃度的姜黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入空白血漿，震蕩后，加入內(nèi)標(biāo)替硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行樣品前處理后，進(jìn)行UHPLC-MS/MS分析，以不同濃度的姜黃素的峰面積與內(nèi)標(biāo)替硝唑的峰面積之比Y 為縱坐標(biāo)，以姜黃素的血藥濃度C為橫坐標(biāo)進(jìn)行直線回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；

S2.樣品檢測(cè)：待測(cè)樣品前處理后，進(jìn)行UHPLC-MS/MS分析。

優(yōu)選地，上文所述前處理的方法為（包括上述步驟（1）、步驟S12和S2中所述前處理）：樣品加入內(nèi)標(biāo)后，旋渦混勻，加入3～5倍體積的乙酸乙酯，旋渦振蕩，靜置2～5min后，離心取有機(jī)層，室溫真空揮干，加入乙腈-醋酸銨溶液溶解，離心取上清，即為供試品溶液，用于UHPLC-MS/MS進(jìn)樣分析。

前處理方法中，優(yōu)選地，所述樣品和內(nèi)標(biāo)的體積比為8～12：1（優(yōu)選10：1）。

優(yōu)選地，所述旋渦混勻的時(shí)間為5～20s（優(yōu)選60s）。

優(yōu)選地，所述旋渦振蕩的時(shí)間為30～90s（優(yōu)選60s）。