[發明專利]一種鴨肝微粒體的制備方法在審
| 申請號： | 201611253896.X | 申請日： | 2016-12-30 |
| 公開（公告）號： | CN108265022A | 公開（公告）日： | 2018-07-10 |
| 發明（設計）人： | 張清;蔣敏;齊來俊 | 申請（專利權）人： | 江蘇齊氏生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/071 | 分類號： | C12N5/071 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 214434 江蘇省無錫市江陰市東*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 超速離心 微粒體 鴨肝 重懸 沉淀 肝臟 肝臟勻漿液 勻漿緩沖液 儲存液 灌洗 預冷 制備 冷凍高速離心 超聲破碎 低速離心 無菌條件 清洗液 斷頭 冰浴 殘血 分裝 剪碎 離體 濕重 亞型 勻漿 清洗 取出 | ||
1.一種鴨肝微粒體的制備方法，其特征在于：（a）斷頭處死實驗鴨，無菌條件下，清洗液灌洗肝臟；（b）取出肝臟，離體灌洗肝臟，進一步清洗肝中殘血；（c）按一定的肝濕重比加入預冷的勻漿緩沖液，充分剪碎，冰浴中勻漿；（d）將肝臟勻漿液低速離心，分別收集上清和沉淀，沉淀加入一定量預冷的勻漿緩沖液重懸，超聲破碎，肝臟勻漿液經冷凍高速離心后收集上清；（e）轉移至超速離心管中，超速離心后棄上清，加入儲存液重懸，再次超速離心，所得沉淀經儲存液重懸分裝；（f）HPLC檢測鴨肝微粒體亞型酶CYP3A4和CYP2E1的活性。
2.根據權利要求1所述的一種鴨肝微粒體制備方法，其特征在于，所述的步驟a中實驗鴨為體重為1-1.5 kg，21-30日齡齡的雄性鴨。
3.根據權利要求1所述的一種鴨肝微粒體制備方法，其特征在于，所述的步驟a中灌洗肝臟用的清洗液為10 mM PBS（含0.15M KCl和0.2%尼克酰胺，pH 7.4）。
4.根據權利要求1所述的一種鴨肝微粒體制備方法，其特征在于，所述的步驟c中肝濕重比的比例為1:2-1:3，所述的勻漿緩沖液為含0.15M KCl、1mM EDTA和1mM PMSF的0.05MTris-HCL（pH7.4）。
5.根據權利要求1所述的一種鴨肝微粒體制備方法，其特征在于，所述的步驟d中低速離心的方式為，4 ℃，1500 rpm/min，離心5 min。
6.根據權利要求1所述的一種鴨肝微粒體制備方法，其特征在于，所述的步驟d中加入預冷的勻漿緩沖液的量是沉淀重量的1-2倍。
7.根據權利要求1所述的一種鴨肝微粒體制備方法，其特征在于，所述的步驟d中超聲破碎的功率為180-250 W、超聲時間為4-5 s，間隔時間為8-10 s，超聲次數為15-20次。
8.根據權利要求1所述的一種鴨肝微粒體制備方法，其特征在于，所述的步驟e中超速離心的速度為100000 ×g，首次超速離心的時間為75 min，再次超速離心的時間為45 min。
9.根據權利要求1所述的一種鴨肝微粒體制備方法，其特征在于，所述的步驟e中儲存液為含0.25M蔗糖、20%甘油、1mM EDTA和0.15M KCl的0.1M 磷酸緩沖液（pH7.4）。
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