[發明專利]一種鴨肝微粒體的制備方法

在審

• 申請號: 201611253896.X
• 申請日: 2016-12-30
• 公開（公告）號: CN108265022A
• 公開（公告）日: 2018-07-10
• 發明（設計）人: 張清;蔣敏;齊來俊
• 申請（專利權）人: 江蘇齊氏生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供一種鴨肝微粒體的制備方法，包括步驟：（a）斷頭處死實驗鴨，無菌條件下，清洗液灌洗肝臟；（b）取出肝臟，離體灌洗肝臟，進一步清洗肝中殘血；（c）按一定的肝濕重比加入預冷的勻漿緩沖液，充分剪碎，冰浴中勻漿；（d）將肝臟勻漿液低速離心，分別收集上清和沉淀，沉淀加入一定量預冷的勻漿緩沖液重懸，超聲破碎，肝臟勻漿液經冷凍高速離心后收集上清；（e）轉移至超速離心管中，超速離心后棄上清，加入儲存液重懸，再次超速離心，所得沉淀經儲存液重懸分裝；（f）HPLC檢測鴨肝微粒體亞型酶CYP3A4和CYP2E1的活性。

技術領域

本發明屬于蛋白酶學領域，具體涉及一種鴨肝微粒體的制備方法。

背景技術

鴨肝微粒體是鴨肝臟內質網膜的亞細胞組分，富含大量的藥物代謝酶：細胞色素P450酶。細胞色素P450酶廣泛的參與了類固醇、膽酸、脂肪酸、前列腺素、白三烯、生物胺以及類維生素等物質的生物合成和代謝；因此，常用作體外研究藥物代謝和藥物相互作用的主要工具。有關禽類動物肝微粒體鮮有報道，本發明旨在提供一種簡單易操作的鴨肝微粒體制備方法。

發明內容

本發明的目的是建立一種鴨肝微粒體的制備方法。

為了解決上述所涉及到的問題，本發明采取如下方法制備鴨肝微粒體：鴨肝微粒體制備方法的步驟包括：（a）斷頭處死實驗鴨，無菌條件下，清洗液灌洗肝臟；（b）取出肝臟，離體灌洗肝臟，進一步清洗肝中殘血；（c）按一定的肝濕重比加入預冷的勻漿緩沖液，充分剪碎，冰浴中勻漿；（d）將肝臟勻漿液低速離心，分別收集上清和沉淀，沉淀加入一定量預冷的勻漿緩沖液重懸，超聲破碎，肝臟勻漿液經冷凍高速離心后收集上清；（e）轉移至超速離心管中，超速離心后棄上清，加入儲存液重懸，再次超速離心，所得沉淀經儲存液重懸分裝；（f）HPLC檢測鴨肝微粒體亞型酶CYP3A4和CYP2E1的活性。

可選的鴨為體重為1-1.5 kg，21-30日齡齡的雄性鴨；

可選的灌洗肝臟用的清洗液為10 mM PBS（含0.15M KCl和0.2%尼克酰胺，pH 7.4）；

可選的肝濕重比的比例為1:2-1:3；

可選的勻漿緩沖液為含0.15M KCl、1mM EDTA、1mM PMSF的0.05M Tris-HCL（pH7.4）；

可選的加入預冷的勻漿緩沖液的量是沉淀重量的1-2倍；

可選的超聲破碎的功率為180-250 W、超聲時間為4-5 s，間隔時間為8-10 s，超聲次數為15-20次；

可選的超速離心的速度為100000 ×g，首次超速離心的時間為75 min，再次超速離心的時間為45 min；

可選的儲存液為含0.25M蔗糖、20%甘油、1mM EDTA和0.15M KCl的0.1M 磷酸緩沖液（pH7.4）。

附圖說明

圖1：HPLC檢測鴨肝微粒體CYP3A4活性的峰圖

圖2：HPLC檢測鴨肝微粒體CYP2E1活性的峰圖

圖3：鴨肝微粒體CYP3A4和CYP2E1反應速率圖

具體實施方式

為了使本發明的目的及優勢更清新地展現，現將具體實施方式進一步闡述。此處所闡述的具體實施方式僅針對本發明進行解釋，并不用于限定本發明。

本發明選擇體重為1.5 kg的雄性30日齡的麻鴨制備鴨肝微粒體。具體操作如下：

1、禁食，正常飲水24 h后斷頭處死實驗鴨；