[發明專利]心肌細胞培養液及培養方法

有效

• 申請號: 201611252382.2
• 申請日: 2016-12-30
• 公開（公告）號: CN106867964B
• 公開（公告）日: 2020-04-21
• 發明（設計）人: 高歌
• 申請（專利權）人: 上海愛薩爾生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 上海領洋專利代理事務所(普通合伙) 31292
• 代理人: 劉秋蘭

1.一種基于外周血單核細胞的心肌細胞培養液，其特征在于，所述培養液由：體積比為100:0.8～1.8的DMEM/F12基礎培養基和胰島素轉鐵蛋白亞硒酸鹽補充液、腺苷酸環化酶激活劑、L-抗壞血酸、L-谷氨酰胺、鈣通道激活劑、RSK 2抑制劑、GSK 3抑制劑、ALK-4,5,7抑制劑和纖維母細胞生長因子組成；所述腺苷酸環化酶激活劑為毛喉素；所述鈣通道激活劑為Bay K 8644；所述RSK 2抑制劑為AT7867或BI-D1870；所述GSK 3抑制劑為SB216763或SB415286；所述ALK-4,5,7抑制劑為SB505124；所述腺苷酸環化酶激活劑濃度為4～10μmol/L；所述L-抗壞血酸濃度為0.08～0.14mmol/L，所述L-谷氨酰胺濃度為4～15mmol/L，所述鈣通道激活劑濃度為20～80nmol/L，所述RSK 2抑制劑濃度為30～150nmol/L，所述GSK 3抑制劑濃度為60～150nmol/L，所述ALK-4,5,7抑制劑濃度為50～200nmol/L，所述纖維母細胞生長因子濃度為0.6～0.18mmol/L。

2.如權利要求1所述的培養液，其特征在于，DMEM/F12基礎培養基和胰島素轉鐵蛋白亞硒酸鹽補充液的體積比為100:1～1.5；所述腺苷酸環化酶激活劑濃度為6～8μmol/L；所述L-抗壞血酸濃度為0.09～0.12mmol/L；所述L-谷氨酰胺濃度為8～10mmol/L；所述鈣通道激活劑濃度為50～60nmol/L；所述RSK 2抑制劑濃度為80～100nmol/L；所述GSK 3抑制劑濃度為80～100nmol/L；所述ALK-4,5,7抑制劑濃度為100～150nmol/L；纖維母細胞生長因子濃度為0.10～0.15mmol/L。

3.如權利要求2所述的培養液，其特征在于，DMEM/F12基礎培養基和胰島素轉鐵蛋白亞硒酸鹽補充液的體積比為100:1；所述腺苷酸環化酶激活劑濃度為6μmol/L；所述L-抗壞血酸濃度為0.10mmol/L；所述L-谷氨酰胺濃度為10mmol/L；所述鈣通道激活劑濃度為50nmol/L；所述RSK 2抑制劑濃度為80nmol/L；所述GSK 3抑制劑濃度為100nmol/L；所述ALK-4,5,7抑制劑濃度為150nmol/L；所述纖維母細胞生長因子濃度為0.15mmol/L。

4.一種由外周血單核細胞培養心肌細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)用權利要求1～3任一項所述的培養液對外周血單核細胞進行培養得到原代培養物；

2)原代培養物用所述培養液進行分化培養15～20天得到心肌細胞。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于：

步驟1)具體為，于35～39℃、3～7％CO₂條件下，用所述培養液對外周血單核細胞進行原代培養2～5天，原代培養期間不用更換培養液；

步驟2)具體為，將步驟1)得到的原代培養物消化下來，于35～39℃、3～7％CO₂條件下用所述培養液進行分化培養15～20天得到心肌細胞，分化培養期間每隔1～3天更換一次培養液。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于：

步驟1)具體為，于37℃、5％CO₂條件下，用所述培養液對外周血單核細胞進行原代培養3天，原代培養期間不用更換培養液；

步驟2)具體為，將步驟1)得到的原代培養物消化下來，于37℃、5％CO₂條件下用所述培養液進行分化培養15～20天得到心肌細胞，分化培養期間每隔1天更換一次培養液。

7.如權利要求5所述的培養方法，其特征在于，所述外周血單核細胞用Ficoll-Paque密度梯度離心法分離患者血樣得到。