[發(fā)明專(zhuān)利]心肌細(xì)胞培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611252382.2
• 申請(qǐng)日: 2016-12-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106867964B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-04-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高歌
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海愛(ài)薩爾生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/077
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/077
• 代理公司: 上海領(lǐng)洋專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙) 31292
• 代理人: 劉秋蘭

本發(fā)明公開(kāi)了一種基于外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)心肌細(xì)胞的培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)液包括：體積比為100:0.5～2的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基和胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白亞硒酸鹽(ITS)補(bǔ)充液、腺苷酸環(huán)化酶激活劑、L?抗壞血酸、L?谷氨酰胺衍生物、鈣通道激活劑、RSK 2抑制劑、GSK 3抑制劑和ALK?4,5,7抑制劑。本發(fā)明還公開(kāi)了一種基于外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法，使用所述培養(yǎng)液，可以外周血單核細(xì)胞為原料定向分化培養(yǎng)得到心肌細(xì)胞，取材方便，可避免道德?tīng)?zhēng)議。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于心肌細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種心肌細(xì)胞的培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

心血管疾病一直是人類(lèi)的重大疾病之一。心肌細(xì)胞在心血管疾病的體外疾病模型、藥物篩選、藥物毒理測(cè)試等方面都有應(yīng)用。但是由于心肌細(xì)胞增殖能力有限、原代心肌細(xì)胞取樣困難，因此體外心肌細(xì)胞模型仍然難以大規(guī)模應(yīng)用。目前用于體外心肌模型的心肌細(xì)胞主要有以下幾種來(lái)源：

胚胎源心肌細(xì)胞：主要是胚胎干細(xì)胞(ESCs)誘導(dǎo)分化得到的心肌細(xì)胞。但是人胚胎來(lái)源的心肌細(xì)胞十分有限，目前主要是從流產(chǎn)人胚胎組織中獲取，一直受到爭(zhēng)議。另外，免疫排斥及致癌作用一直限制其使用。因此，胚胎源心肌細(xì)胞應(yīng)用于臨床在來(lái)源及效果方面也有很大的障礙。

組織來(lái)源的心肌細(xì)胞：目前組織來(lái)源的心肌細(xì)胞只是用動(dòng)物來(lái)源的心肌細(xì)胞，活體人心臟組織無(wú)法獲得。而動(dòng)物心肌細(xì)胞的研究模型與人體本身有差異，研究成果仍然難以在人類(lèi)自身直接應(yīng)用。

綜上心肌細(xì)胞的來(lái)源往往受到現(xiàn)有技術(shù)或倫理的限制，從而影響心肌細(xì)胞在臨床中治療心血管疾病的應(yīng)用和研究。

發(fā)明內(nèi)容

因此，本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中心肌細(xì)胞的來(lái)源受到限制的技術(shù)問(wèn)題，目的在于提供一種更加方便取材，可避免道德?tīng)?zhēng)議的基于外周血單核細(xì)胞(PBMC)培養(yǎng)心肌細(xì)胞的定向分化培養(yǎng)液。

本發(fā)明的基于外周血單核細(xì)胞的心肌細(xì)胞培養(yǎng)液包括：體積比為100:0.5～2的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基和胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白亞硒酸鹽(ITS)補(bǔ)充液(購(gòu)自Sigma公司，貨號(hào)I3146)、腺苷酸環(huán)化酶激活劑、L-抗壞血酸、L-谷氨酰胺、鈣通道激活劑、RSK 2抑制劑、GSK3抑制劑、ALK-4,5,7抑制劑。

其中，所述腺苷酸環(huán)化酶激活劑選用毛喉素(Forskolin)，用于通透細(xì)胞，激活腺苷酸環(huán)化酶，從而升高細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平。L-抗壞血酸作為培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)因子。L-谷氨酰胺作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。所述鈣通道激活劑可選用BayK 8644(中文名：1,4-二氫-2,6-二甲基-5-硝基-4-(2-[三氟甲基]苯基)吡啶-3-羧酸甲酯，CAS號(hào)：71145-03-4)；所述RSK 2抑制劑可選用AT7867(中文名：4-(4-(1氫-吡唑-4-基)苯基)-4-(4-氯苯基)哌啶，CAS號(hào)：857531-00-1)或BI-D1870(中文名：2-[(3,5-二氟-4-羥基苯基)氨基]-7,8-二氫-5,7-二甲基-8-(3-甲基丁基)-6(5H)-蝶啶酮，CAS號(hào)：501437-28-1)；所述GSK 3抑制劑可選用SB216763(中文名：3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1氫-吲哚-3-基)-1氫-吡咯-2,5-二酮，CAS號(hào)：280744-09-4)或SB415286(中文名：3-[(3-氯-4-羥苯基)氨基]-4-(2-硝苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮，CAS號(hào)：264218-23-7)；所述ALK-4,5,7抑制劑可選用SB505124(中文名：2-(5-二烷基[1,3]二氧環(huán)戊-5-基-2-叔丁基-3氫-咪唑-4-基)-6-鹽酸甲基吡啶，CAS號(hào)：694433-59-5)或SB431542(中文名：4-[4-(1,3-苯并二唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯酰胺水合物，CAS號(hào)：301836-41-9)。