[發明專利]用于分析重復序列的mPCR方法

在審

• 申請號: 201611252251.4
• 申請日: 2011-10-28
• 公開（公告）號: CN106868107A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: G.J.拉薩姆;L.陳;A.哈德;S.薩;R.曹
• 申請（專利權）人: 奧斯瑞根公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所11105
• 代理人: 張文輝

本申請是申請日為2011年10月28日，申請號為201180063284.3，發明名稱為“用于分析重復序列的mPCR方法”的中國專利申請的分案申請。

本申請要求2010年10月29日提交的美國臨時申請No.61/408,367的權益，其通過提述完整并入本文。

本申請中所描述的工作在來自Eunice Kennedy Shriver國立兒童健康和人類發展研究所(National Institute of Child Health&Human Development)的撥款號R43HD060450和R44HD060450下部分得到聯邦政府資助。因而，聯邦政府可以具有本發明的某些權利。

本發明屬于核酸分析領域，特別地，涉及用于測定富含GC的模板和產物的甲基化狀態的方法。另外，本發明涉及可以依照本文中所描述的方法使用的GC參照標準品。

在某些實施方案中，使用本文中所描述的方法來測定富含GC的基因座的甲基化狀態。在一些情況中，富含GC的區域的擴充與各種疾病狀態有關。與CGG重復擴充有關的基因座的例子是X染色體上脆性X智力低下-1基因(FMR1)的5’非翻譯區(UTR)。此區域中擴充成大于200個CGG重復與FMR1基因的超甲基化有關，并且稱為“完全突變”等位基因。這些等位基因與FMR1蛋白生成的損失及病癥脆性X綜合征(FXS)有關。FXS可以包括智力低下、孤獨癥、卵巢功能早衰、及其它認知和行為狀態。(J.Mol Diag.10(6):496-501(2008))。

用于測定富含GC的模板和FMR1的甲基化狀態的方法包括Southern印跡(SB)分析和聚合酶鏈式反應(PCR)策略。SB分析提供了三聯體重復區的大小的粗略測量和甲基化的評估。可以使用甲基化敏感性酶(其不切割甲基化位點)來區別甲基化的和未甲基化的等位基因。然而，通過SB分析測定甲基化狀態限于通過凝膠電泳充分解析的等位基因。SB分析還受到需要的基因組DNA(gDNA)材料的量和與高通量規程不相容的繁重工作流限制。(Genet.Med.7(8):584-587(2005))。

PCR策略可以在測定三聯體重復區的大小中提供較大的準確性。然而，擴增富含GC的長序列(包括FMR1 5’UTR的完全突變等位基因)中的限制已經約束重復區的量化。例如，已經嘗試了對FMR1PCR的優化，并且其包括對常規PCR測定條件的修改。(見Genome Res.6(7):633-8,(1996)；J.Mol.Diagn.8:544-550,(2006)；及Am J Med Genet.51(4):527-34,(1994))。新近，已經開發出允許可靠擴增超過200個CGG重復的PCR技術。見美國申請No.2010/0209970，其通過提述完整并入本文。然而，單獨的PCR不允許表征富含GC的模板的甲基化狀態。

幾種策略組合PCR與用于評估甲基化的其它方法。大多數方法已經利用5-甲基胞嘧啶對亞硫酸氫鹽轉化(bisulfite conversion)的抗性以揭示甲基化狀態。然而，對于FMR1，例如，基于亞硫酸氫鹽的甲基化PCR方法實際上已經限于僅評估男性樣品，這是由于混淆女性樣品解讀的混合甲基化狀態，和/或所述方法已經表明對擴充等位基因的有限效用。(見Hum.Mutation 14:71-79,(1999)；Clin.Chem.52:1492-1500,(2006)；J.Med.Genet.41:1-8,(2004)；及Hum.Genet.108:450-458,(2001))。已經報告了亞硫酸氫鹽處理的備選，諸如使用甲基化敏感性限制酶，然而，對女性樣品的分析仍然是有問題的。(J.Mol Diag.10(6):496-501,(2008))。

至今，除了SB外沒有單一辦法在男性和女性樣品兩者中表明對擴充等位基因的精確甲基化評估。因此，需要可以用于表征富含GC的基因座的甲基化和重復狀態的快速的、精確的、具有簡單工作流的測定法。

本文中所描述的方法涉及基于PCR的技術，其可以在男性和女性樣品兩者中檢測并解析富含GC的重復長度范圍間的甲基化狀態。總體工作流適合于常規測試和高通量篩選應用，并且為不需要SB分析的全面FMR1分析提供基礎。

在一個實施方案中，所述方法涉及表征DNA樣品中的FMR基因座，包括下列步驟：

a)使所述樣品的第一部分與甲基化敏感性DNA酶接觸；

b)將GC參照標準品添加至所述樣品，其中所述參照標準品具有至少75％GC豐度；