[發明專利]用于分析重復序列的mPCR方法

在審

• 申請號: 201611252251.4
• 申請日: 2011-10-28
• 公開（公告）號: CN106868107A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: G.J.拉薩姆;L.陳;A.哈德;S.薩;R.曹
• 申請（專利權）人: 奧斯瑞根公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所11105
• 代理人: 張文輝

1.一種表征DNA樣品中FMR基因座的方法，包括下列步驟：

a)使所述樣品的第一部分與甲基化敏感性DNA酶接觸；

b)將GC參照標準品添加至所述樣品，其中所述參照標準品具有至少75％GC豐度；

c)將所述樣品的所述第一部分和第二部分進行DNA擴增反應，所述第一部分和第二部分各自含有所述GC參照標準品，其中用不同標記物標記每個部分中擴增的DNA；并

d)分析來自所述樣品的所述第一和所述第二部分的擴增的DNA，由此表征所述FMR基因座的甲基化狀態。

2.權利要求1的方法，其中步驟(d)包括毛細管電泳(CE)。

3.權利要求2的方法，其中所述GC參照標準品缺乏所述甲基化敏感性DNA酶的識別位點。

4.權利要求2的方法，其中在單次CE運行中分析來自所述第一和所述第二部分的所述擴增的DNA。

5.權利要求2的方法，其中所述GC參照標準品具有與天然存在的FMR等位基因不重疊的CE遷移時間。

6.權利要求2的方法，其中所述GC參照標準品具有小于約20、約24至27、或大于約32個CGG重復的相對保留時間。

7.權利要求2的方法，其中所述GC參照標準品具有小于約3個CGG重復的相對保留時間。

8.權利要求2的方法，其中所述GC參照標準品具有約175至約225個CGG重復的相對保留時間。

9.權利要求1的方法，其中所述甲基化敏感性DNA酶選自Hpa II、Eag I、或Nru I。

10.權利要求1的方法，其中所述擴增反應能夠擴增至少200個CGG重復。

11.權利要求10的方法，其中所述擴增反應包含具有大于1的GC/AT比率的dNTP混合物。

12.權利要求11的方法，其中所述GC/AT比率是約2.5至約10。

13.權利要求1的方法，其中所述FMR基因座是FMR1基因座。

14.權利要求1的方法，其中在使所述第一部分與所述DNA酶接觸后將所述GC參照標準品添加至所述樣品。

15.權利要求1的方法，其中在使所述第一部分與所述DNA酶接觸前將所述GC參照標準品添加至所述樣品。

16.權利要求1的方法，其進一步包括使所述樣品的所述第二部分與對照酶接觸。

17.權利要求16的方法，其中所述對照酶選自EcoRI和Sau3A1。

18.權利要求16的方法，其中在使所述第一部分與所述DNA酶接觸前將所述GC參照標準品添加至所述樣品，且所述對照酶選自HindIII-HF、EcoRI、DpnI、和NaeI。

19.權利要求1的方法，其進一步包括在使所述樣品的所述第一部分與所述甲基化敏感性DNA酶接觸前將消化對照添加至所述樣品。

20.權利要求19的方法，其中所述消化對照具有小于約3個CGG重復的相對保留時間，所述GC參照標準品具有小于約3個CGG重復的相對保留時間，且所述消化對照擴增產物和所述參照標準品的相對保留時間相差約4個CGG重復或更多。

21.一種分析人DNA樣品的方法，包括下列步驟：

a)使所述樣品的第一部分與甲基化敏感性DNA酶接觸；

b)將GC參照標準品添加至所述樣品，其中所述參照標準品具有至少75％GC豐度；

c)將所述樣品的所述第一部分和第二部分進行DNA擴增反應，其中用不同標記物標記每個部分中的擴增DNA；并

d)分析來自所述樣品的所述第一和所述第二部分的擴增DNA，由此檢測與脆性X綜合征、脆性X關聯震顫共濟失調綜合征、和/或脆性X關聯原發性卵巢功能不全有關的基因型。