[發明專利]一種特異性的檢測弓形蟲的方法

有效

• 申請號: 201611251808.2
• 申請日: 2016-12-30
• 公開（公告）號: CN108265070B
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發明（設計）人: 朱傳剛;王釗哲;許瑞;林矯矯;陳兆國;洪煬;陸珂;李浩;吳思敏;李嘉靜;江嘉欣
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院上海獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/62;C07K19/00;C07K1/22
• 代理公司: 上海碩力知識產權代理事務所(普通合伙) 31251
• 代理人: 郭桂峰

本發明公開了一種特異性的檢測弓形蟲的方法。所述方法包括以下步驟：1、重構弓形蟲SAG1和SAG2抗原表位基因序列；2、連接轉化目的基因和載體；3、重組質粒的表達純化；4、表達重組蛋白；5、Western blot檢測重組蛋白的免疫原性；6、ELISA法分析重組蛋白的免疫原性。所述方法靈敏度高，操作簡單且無二次污染。

技術領域：

本發明涉及一種免疫檢測方法，具體涉及一種特異性的檢測弓形蟲的方法。

背景技術：

弓形蟲屬真球蟲目，弓形蟲科，是一種分布廣泛的專性細胞內寄生蟲，最早發現于1908年。該病呈世界性分布，廣泛存在于溫血動物中，其中貓科動物為其終宿主和重要的傳染源。弓形蟲感染人體后可使患者出現急性弓形蟲腦炎而死亡。感染家畜后主要表現出流產、產死胎和弱畜，給人類和養殖業造成嚴重威脅。弓形蟲速殖子是機體免疫系統識別的主要部位，其表膜蛋白抗原(SAG)由SAG基因家族編碼。SAG1位于弓形蟲速殖子表面，可以誘導宿主的免疫應答；SAG2是速殖子表膜的另一主要抗原，可介導弓形蟲速殖子的入侵，這兩種抗原均具有較強的免疫原性。目前，對血清特異性抗體進行檢測時常用的是蟲源性粗抗原，因其成分復雜，導致特異性較差，并容易產生交叉感染，最終影響檢測效果。

目前國內外學者多用從感染動物中收集或經組織、細胞培養的弓形蟲速殖體作為抗原，該方法雖然操作方便，特異性較好，但抗原純度較低，成分復雜，容易出現交叉反應。而在原核表達系統中表達出的特異性目的蛋白，因蛋白產量高、操作簡單、費用低廉等優勢，成為眾多學者研究的對象。因此，建立一種重組抗原作為診斷抗原檢測弓形蟲病的方法勢在必行。

SAG1和SAG2抗原都是弓形蟲速殖子期特異性表膜抗原，以糖磷脂酰化形式錨定在細胞膜上，以阻止吞噬細胞對侵襲的弓形蟲進行吞噬消化。SAG1主要與弓形蟲毒力相關，并己證實該基因編碼的重組抗原可作為診斷抗原，用于弓形蟲速殖子感染的免疫學檢測；SAG2與弓形蟲入侵宿主細胞有密切的關系，SAG2抗原可以使弓形蟲固定于有核細胞的表面，并輔助弓形蟲進入有核細胞，介導弓形蟲速殖子的入侵過程。有研究表明，弓形蟲感染后的血清抗體能夠識別SAG1和SAG2表面抗原，抗SAG2蛋白抗體也可以阻斷弓形蟲的再定位，還有可能在弓形蟲速殖子向緩殖子轉化的過程中起作用，因此重組蛋白的表達對于蛋白疫苗的制備意義重大。

發明內容：

本發明的目的在于，提供一種特異性的檢測弓形蟲的方法。本發明方法對弓形蟲抗原基因進行生物學分析，設計并合成弓形蟲膜表面抗原SAG1和SAG2重構基因，將目的基因與PET-28a(+)表達質粒連接，并成功轉化至大腸埃希氏桿菌BL21(DE3)中表達，得到帶有His標簽的融合蛋白，通過His親和層析柱對融合蛋白進行純化，獲得高濃度、高純度的目的蛋白，之后用1×PBS溶液對純化后的蛋白進行透析。Western blot檢測結果顯示，表達后融合蛋白可以與小鼠弓形蟲陽性血清發生特異性結合；ELISA檢測結果顯示，不同稀釋倍數的融合蛋白與不同濃度的小鼠陽性血清均可發生反應，并能很好的區分陰性陽性血清，說明該融合蛋白具有較好的免疫原性，為弓形蟲診斷方法的建立及相應核酸疫苗的研發奠定基礎。

為解決上述問題，本發明采用以下技術方案：

一種特異性的檢測弓形蟲的方法，包括以下步驟：

1、重構弓形蟲SAG1和SAG2抗原表位基因序列

重構弓形蟲SAG1和SAG2抗原表位基因序列如SEQ ID NO:1所示。

2、連接轉化目的基因和載體

將目的基因與PET-28a(+)載體連接后，轉化至BL21(DE3)感受態細胞，挑取完整單個菌落于LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜。之后進行菌液PCR，雙酶切、測序鑒定。

3、重組質粒的表達純化