[發明專利]重組菌株及其制備方法和生產L-蘇氨酸的方法

有效

• 申請號: 201611250306.8
• 申請日: 2016-12-29
• 公開（公告）號: CN106635945B
• 公開（公告）日: 2020-05-26
• 發明（設計）人: 張捧;程江紅;刁劉洋;毛賢軍
• 申請（專利權）人: 廊坊梅花生物技術開發有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P13/08;C12R1/19
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

本發明涉及微生物技術領域，特別涉及重組菌株及其制備方法和生產L?蘇氨酸的方法。該重組菌株以大腸桿菌為出發菌株進行改造，其改造包括：強化pntAB基因和異源引入pyc基因。本發明得到重組菌株經發酵培養，產蘇氨酸的量可達12.4g/L，糖酸轉化率可達16.2％，且在發酵培養過程中無副產物乙酸形成。

技術領域

本發明涉及微生物技術領域，特別涉及重組菌株及其制備方法和生產L-蘇氨酸的方法。

背景技術

L-蘇氨酸(Thr)是人和動物生長所必需的8種氨基酸之一，其廣泛應用于飼料、食品添加及藥物輔助材料制備等。蘇氨酸是一種重要的營養強化劑，可以強化谷物、糕點、乳制品，和色氨酸一樣有緩解人體疲勞，促進生長發育的效果。醫藥上，由于蘇氨酸的結構中含有羥基，對人體皮膚具有持水作用，與寡糖鏈結合，對保護細胞膜起重要作用，在體內能促進磷脂合成和脂肪酸氧化。其制劑具有促進人體發育抗脂肪肝藥用效能，是復合氨基酸輸液中的一個成分。同時，蘇氨酸又是制造一類高效低過敏的抗生素-單酰胺菌素的原料。

目前L-蘇氨酸主要通過微生物發酵生產，多種細菌可用于L-蘇氨酸生產，如大腸桿菌、棒狀桿菌屬、沙雷氏菌屬等的野生型誘導獲得的突變株作為生產菌株。具體實例包括抗氨基酸類似物突變株或甲硫氨酸、賴氨酸、異亮氨酸等多種營養缺陷型(日本專利申請公開號224684/83；韓國專利申請公開號8022/87)。然而，傳統誘變育種由于隨機突變造成菌株生長緩慢及產生較多副產物，不易獲得高產菌株。

隨著全球蘇氨酸需求量的不斷增加，高產蘇氨酸菌株的構建和改造尤為重要。2003年韓國CJ株式會社申請的中國專利CN03811059.8中，利用大腸桿菌，通過缺失蘇氨酸操縱子序列的第-56至-18位的39bp序列，增強蘇氨酸合成關鍵基因thrABC表達，蘇氨酸生產力提高22％。2016年梅花集團申請的中國專利201610119758.6中，通過強化thrA*BC、敲除tdh獲得MHZ-0213-3菌株，該菌株蘇氨酸產量為4.2g/L、轉化率約為8.9％，且無質粒負擔。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了重組菌株及其制備方法和生產L-蘇氨酸的方法。本發明提供的重組菌株經發酵培養，產蘇氨酸的量可達12.4g/L，糖酸轉化率可達16.2％。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種重組菌株，以大腸桿菌為出發菌株進行改造，其改造包括：強化pntAB基因和異源引入pyc基因。

作為優選，強化pntAB基因為：將pntAB基因的天然啟動子更換為Ptac啟動子。本領域技術人員認為可行的其它可強化pntAB基因的方法同樣在本發明的保護范圍之內。

作為優選，pyc基因的來源為谷氨酸棒狀桿菌。本領域技術人員認為可行的其它來源的pyc基因同樣在本發明的保護范圍之內。

在本發明提供的實施例中，出發菌株為大腸桿菌MHZ-0213-3。

在本發明提供的一實施例中，重組菌株的保藏編號為CGMCC No.13403。

本發明還提供了一種重組菌株的構建方法，包括：以大腸桿菌為出發菌株進行改造，其改造包括：強化pntAB基因和異源引入pyc基因。

作為優選，強化pntAB基因為：將pntAB基因的天然啟動子更換為Ptac啟動子。

作為優選，pyc基因的來源為谷氨酸棒狀桿菌。

在本發明提供的實施例中，出發菌株為大腸桿菌MHZ-0213-3。

作為優選，改造采用CRISPR-Cas9基因編輯技術進行。

本發明還提供了一種生產L-蘇氨酸的方法，采用本發明的重組菌株或本發明構建方法構建得到的重組菌株為發酵菌株。