[發明專利]重組菌株及其制備方法和生產L-蘇氨酸的方法有效
| 申請號: | 201611250306.8 | 申請日: | 2016-12-29 |
| 公開(公告)號: | CN106635945B | 公開(公告)日: | 2020-05-26 |
| 發明(設計)人: | 張捧;程江紅;刁劉洋;毛賢軍 | 申請(專利權)人: | 廊坊梅花生物技術開發有限公司 |
| 主分類號: | C12N1/21 | 分類號: | C12N1/21;C12N15/70;C12P13/08;C12R1/19 |
| 代理公司: | 北京集佳知識產權代理有限公司 11227 | 代理人: | 趙青朵 |
| 地址: | 065001 河*** | 國省代碼: | 河北;13 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關鍵詞: | 重組 菌株 及其 制備 方法 生產 蘇氨酸 | ||
1.一種重組菌株,其特征在于,以大腸桿菌MHZ-0213-3為出發菌株進行改造,其改造包括:強化pntAB基因和異源引入pyc基因;
所述強化pntAB基因為:將pntAB基因的天然啟動子更換為Ptac啟動子;其構建方法包括如下步驟:
(一)制備強化pntAB基因的菌株MHZ-0213-3(Ptac-pntAB)
(1)構建pTargetT-Ptac-pntAB質粒
Step1:以pTargetT質粒為模板,利用引物對gRNApntABup-f1/gRNApntABdn-r1擴增得到pntAB的sgRNA片段①;
Step2:以W3110基因組為模板,利用引物對pntABup-f1/Ptac-pntABup-r1擴增得到Ptac-pntAB左半段②;
Step3:仍然以W3110基因組為模板,利用引物對Ptac-pntABdn-f1/pntABdn-r1擴增獲得Ptac-pntAB右半段③;
Step4:以①②③為模版,利用兩端引物gRNApntABup-f1/pntABdn-r1進行OE-PCR擴增得到gRNA-Ptac-pntAB片段,全長0.9kb;
Step5:使用SpeI/PstI對獲得的gRNA-Ptac-pntAB片段和pTargetT載體進行雙酶切,利用T4 DNA連接酶將目的片段與載體進行連接,并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞中,用以擴增和篩選,最終獲得pTargetT-Ptac-pntAB質粒;
(2)感受態細胞制備及電轉化pTargetT-Ptac-pntAB質粒
Step1:將pCas質粒電轉入MHZ-0213-3感受態細胞中;
Step2:挑取MHZ-0213-3(pCas)單菌落于5mL含卡那霉素和終濃度為10mM阿拉伯糖的LB試管中,30℃200r/min培養至OD650為0.4后制備電轉感受態細胞;
Step3:將pTargetT-Ptac-pntAB質粒電轉入MHZ-0213-3(pCas)感受態細胞中,電轉化條件:2.5kV,200Ω,25μF,涂布于含壯觀霉素和卡那霉素的LB平板上,30℃靜置培養至單菌落可見;
(3)重組驗證
Step1:使用引物對pntAB-up/pntAB-dn對上述單菌落進行菌落PCR驗證,陽性片段0.9kb;
Step2:菌落PCR驗證正確的菌株,進一步測序驗證;
(4)構建相關質粒丟失
Step1:挑取測序驗證正確的單菌落接種于5mL含卡那霉素及終濃度為0.5mM IPTG的LB試管中,30℃過夜培養后劃線于含卡那霉素的LB平板上;
Step2:挑取單菌落對點于含卡那霉素、壯觀霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上,30℃過夜培養,若在含卡那霉素、壯觀霉素的LB平板上不能生長,在卡那霉素的LB平板上生長,表明pTargetT-Ptac-pntAB質粒已丟失;
Step3:挑取pTargetT-Ptac-pntAB質粒丟失的陽性菌落,接種于無抗LB試管中,42℃培養8h后劃線于LB平板上,37℃過夜培養;
Step4:挑取單菌落對點于含卡那霉素LB平板和無抗LB平板上,若在含卡那霉素的LB平板上不能生長,在無抗LB平板上生長,表明pCas質粒丟失,得到MHZ-0213-3(Ptac-pntAB)菌株;
(二)制備異源引入P1-pyc基因的菌株MHZ-0213-3(IS4::P1-pyc)
(1)構建pTargetT-P1-pyc質粒
Step1:以pTargetT質粒為模板,利用引物對gRNAIS4up-For/gRNAIS4 up-Rev擴增得到P1-pyc的sgRNA片段①;
Step2:以W3110基因組為模板,利用引物對P1pyc up-For/P1pyc up-Rev擴增得到IS4-up片段②;
Step3:以W3110基因組為模板,利用引物對P1pyc-For/P1pyc-Rev擴增獲得P1pyc片段③;
Step4:以W3110基因組為模板,利用引物對P1pyc down-For/P1pyc down-Rev擴增得到IS4-down片段④;
Step5:以①②③④為模版,利用兩端引物gRNAIS4 up-For/P1pyc down-Rev進行OE-PCR擴增得到gRNA-P1pyc片段,全長4.8kb;
Step6:使用SpeI/PstI對獲得的gRNA-P1pyc片段和pTargetT載體進行雙酶切,利用T4DNA連接酶將目的片段與載體進行連接,并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞中,用以擴增和篩選,最終獲得pTargetT-P1pyc質粒;
(2)感受態細胞制備及電轉pTargetT-P1-pyc質粒
Step1:將pCas質粒電轉入MHZ-0213-3感受態細胞中;
Step2:挑取MHZ-0213-3(pCas)單菌落于5mL含卡那霉素和終濃度為10mM阿拉伯糖的LB試管中,30℃200r/min培養至OD650為0.4后制備電轉感受態細胞;
Step3:將pTargetT-P1pyc質粒電轉入MHZ-0213-3(pCas)感受態細胞中,電轉化條件:2.5kV,200Ω,25μF,涂布于含壯觀霉素和卡那霉素的LB平板上,30℃靜置培養至單菌落可見;
(3)重組驗證
Step1:使用引物對P1pyc up/P1pyc down對上述單菌落進行菌落PCR驗證,陽性片段4.8kb;
Step2:菌落PCR驗證正確的菌株,進一步測序驗證;
(4)構建相關質粒丟失
pTargetT-P1-pyc、pCas質粒丟失方法同步驟(一),得到MHZ-0213-3(IS4::P1-pyc)菌株;
(三)制備強化pntAB基因并同時異源引入P1-pyc基因的菌株MHZ-0213-3(Ptac-pntAB,IS4::P1-pyc)
(1)構建pTargetT-P1-pyc質粒
使用步驟(二)中所構建完成的質粒;
(2)感受態細胞制備及電轉pTargetT-P1-pyc質粒
Step1:將pCas質粒電轉入MHZ-0213-3(Ptac-pntAB)感受態細胞中;
Step2:挑取MHZ-0213-3(Ptac-pntAB,pCas)單菌落于5mL含卡那霉素和終濃度為10mM阿拉伯糖的LB試管中,30℃200r/min培養至OD650為0.4后制備電轉感受態細胞;
Step3:將pTargetT-P1pyc質粒電轉入MHZ-0213-3(Ptac-pntAB,pCas)感受態細胞中,電轉化條件:2.5kV,200Ω,25μF,涂布于含壯觀霉素和卡那霉素的LB平板上,30℃靜置培養至單菌落可見;
(3)重組驗證
Step1:使用引物對P1pyc up/P1pyc down對上述單菌落進行菌落PCR驗證,陽性片段4.8kb;
Step2:菌落PCR驗證正確的菌株,進一步測序驗證;
(4)構建相關質粒丟失
pTargetT-P1-pyc、pCas質粒丟失方法同步驟(一),得到MHZ-0213-3(Ptac-pntAB,IS4::P1-pyc)菌株,即保藏編號為CGMCC No.13403的MHZ-0215-2。
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