[發明專利]重組菌株及其制備方法和生產L-蘇氨酸的方法

有效

• 申請號: 201611250306.8
• 申請日: 2016-12-29
• 公開（公告）號: CN106635945B
• 公開（公告）日: 2020-05-26
• 發明（設計）人: 張捧;程江紅;刁劉洋;毛賢軍
• 申請（專利權）人: 廊坊梅花生物技術開發有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P13/08;C12R1/19
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

1.一種重組菌株，其特征在于，以大腸桿菌MHZ-0213-3為出發菌株進行改造，其改造包括：強化pntAB基因和異源引入pyc基因；

所述強化pntAB基因為：將pntAB基因的天然啟動子更換為Ptac啟動子；其構建方法包括如下步驟：

(一)制備強化pntAB基因的菌株MHZ-0213-3(Ptac-pntAB)

(1)構建pTargetT-Ptac-pntAB質粒

Step1:以pTargetT質粒為模板，利用引物對gRNApntABup-f1/gRNApntABdn-r1擴增得到pntAB的sgRNA片段①；

Step2:以W3110基因組為模板，利用引物對pntABup-f1/Ptac-pntABup-r1擴增得到Ptac-pntAB左半段②；

Step3:仍然以W3110基因組為模板，利用引物對Ptac-pntABdn-f1/pntABdn-r1擴增獲得Ptac-pntAB右半段③；

Step4:以①②③為模版，利用兩端引物gRNApntABup-f1/pntABdn-r1進行OE-PCR擴增得到gRNA-Ptac-pntAB片段，全長0.9kb；

Step5:使用SpeI/PstI對獲得的gRNA-Ptac-pntAB片段和pTargetT載體進行雙酶切，利用T4 DNA連接酶將目的片段與載體進行連接，并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞中，用以擴增和篩選，最終獲得pTargetT-Ptac-pntAB質粒；

(2)感受態細胞制備及電轉化pTargetT-Ptac-pntAB質粒

Step1：將pCas質粒電轉入MHZ-0213-3感受態細胞中；

Step2：挑取MHZ-0213-3(pCas)單菌落于5mL含卡那霉素和終濃度為10mM阿拉伯糖的LB試管中，30℃200r/min培養至OD₆₅₀為0.4后制備電轉感受態細胞；

Step3：將pTargetT-Ptac-pntAB質粒電轉入MHZ-0213-3(pCas)感受態細胞中，電轉化條件：2.5kV，200Ω，25μF，涂布于含壯觀霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃靜置培養至單菌落可見；

(3)重組驗證

Step1：使用引物對pntAB-up/pntAB-dn對上述單菌落進行菌落PCR驗證，陽性片段0.9kb；

Step2：菌落PCR驗證正確的菌株，進一步測序驗證；

(4)構建相關質粒丟失

Step1：挑取測序驗證正確的單菌落接種于5mL含卡那霉素及終濃度為0.5mM IPTG的LB試管中，30℃過夜培養后劃線于含卡那霉素的LB平板上；

Step2：挑取單菌落對點于含卡那霉素、壯觀霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃過夜培養，若在含卡那霉素、壯觀霉素的LB平板上不能生長，在卡那霉素的LB平板上生長，表明pTargetT-Ptac-pntAB質粒已丟失；

Step3：挑取pTargetT-Ptac-pntAB質粒丟失的陽性菌落，接種于無抗LB試管中，42℃培養8h后劃線于LB平板上，37℃過夜培養；

Step4：挑取單菌落對點于含卡那霉素LB平板和無抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生長，在無抗LB平板上生長，表明pCas質粒丟失，得到MHZ-0213-3(Ptac-pntAB)菌株；

(二)制備異源引入P1-pyc基因的菌株MHZ-0213-3(IS4::P1-pyc)

(1)構建pTargetT-P1-pyc質粒

Step1：以pTargetT質粒為模板，利用引物對gRNAIS4up-For/gRNAIS4 up-Rev擴增得到P1-pyc的sgRNA片段①；

Step2:以W3110基因組為模板，利用引物對P1pyc up-For/P1pyc up-Rev擴增得到IS4-up片段②；

Step3:以W3110基因組為模板，利用引物對P1pyc-For/P1pyc-Rev擴增獲得P1pyc片段③；

Step4:以W3110基因組為模板，利用引物對P1pyc down-For/P1pyc down-Rev擴增得到IS4-down片段④；

Step5:以①②③④為模版，利用兩端引物gRNAIS4 up-For/P1pyc down-Rev進行OE-PCR擴增得到gRNA-P1pyc片段，全長4.8kb；

Step6:使用SpeI/PstI對獲得的gRNA-P1pyc片段和pTargetT載體進行雙酶切，利用T4DNA連接酶將目的片段與載體進行連接，并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞中，用以擴增和篩選，最終獲得pTargetT-P1pyc質粒；

(2)感受態細胞制備及電轉pTargetT-P1-pyc質粒

Step1：將pCas質粒電轉入MHZ-0213-3感受態細胞中；

Step2：挑取MHZ-0213-3(pCas)單菌落于5mL含卡那霉素和終濃度為10mM阿拉伯糖的LB試管中，30℃200r/min培養至OD₆₅₀為0.4后制備電轉感受態細胞；

Step3：將pTargetT-P1pyc質粒電轉入MHZ-0213-3(pCas)感受態細胞中，電轉化條件：2.5kV，200Ω，25μF，涂布于含壯觀霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃靜置培養至單菌落可見；

(3)重組驗證

Step1：使用引物對P1pyc up/P1pyc down對上述單菌落進行菌落PCR驗證，陽性片段4.8kb；

Step2：菌落PCR驗證正確的菌株，進一步測序驗證；

(4)構建相關質粒丟失

pTargetT-P1-pyc、pCas質粒丟失方法同步驟(一)，得到MHZ-0213-3(IS4::P1-pyc)菌株；

(三)制備強化pntAB基因并同時異源引入P1-pyc基因的菌株MHZ-0213-3(Ptac-pntAB，IS4::P1-pyc)

(1)構建pTargetT-P1-pyc質粒

使用步驟(二)中所構建完成的質粒；

(2)感受態細胞制備及電轉pTargetT-P1-pyc質粒

Step1：將pCas質粒電轉入MHZ-0213-3(Ptac-pntAB)感受態細胞中；

Step2：挑取MHZ-0213-3(Ptac-pntAB，pCas)單菌落于5mL含卡那霉素和終濃度為10mM阿拉伯糖的LB試管中，30℃200r/min培養至OD₆₅₀為0.4后制備電轉感受態細胞；

Step3：將pTargetT-P1pyc質粒電轉入MHZ-0213-3(Ptac-pntAB，pCas)感受態細胞中，電轉化條件：2.5kV，200Ω，25μF，涂布于含壯觀霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃靜置培養至單菌落可見；

(3)重組驗證

Step1：使用引物對P1pyc up/P1pyc down對上述單菌落進行菌落PCR驗證，陽性片段4.8kb；

Step2：菌落PCR驗證正確的菌株，進一步測序驗證；

(4)構建相關質粒丟失

pTargetT-P1-pyc、pCas質粒丟失方法同步驟(一)，得到MHZ-0213-3(Ptac-pntAB，IS4::P1-pyc)菌株，即保藏編號為CGMCC No.13403的MHZ-0215-2。