[發(fā)明專利]一種豬偽狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗組合物和應用

在審

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• 申請日: 2016-12-29
• 公開（公告）號: CN108251383A
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發(fā)明（設計）人: 田克恭;李向東;譚菲菲;孫進忠;張許科
• 申請（專利權）人: 普萊柯生物工程股份有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/08;A61K39/245;A61P31/22
• 代理公司: 北京華夏正合知識產權代理事務所(普通合伙) 11017
• 代理人: 韓登營

本發(fā)明涉及一種豬偽狂犬病病毒的自然致弱毒株，以豬偽狂犬病病毒HN1201株的TK基因為基準，該豬偽狂犬病病毒的自然致弱毒株TK基因101～102位之間發(fā)生1個堿基的插入。本發(fā)明的自然致弱毒株制備的疫苗組合物能夠對豬體產生完全保護，其生物安全性好，不存在毒力返強的風險。

技術領域

本發(fā)明涉及一種豬偽狂犬病病毒致弱方法、致弱的病毒株及利用該毒株制備的疫苗組合物，屬于獸用生物制品領域。

背景技術

偽狂犬病，又稱Aujeszky氏病，是由皰疹病毒科(Herpesviridae)α亞科中的豬皰疹病毒Ⅰ型(Suid herpesvirus 1strain)所引起的豬、牛、羊等多種家畜、家禽和野生動物的一種以發(fā)熱、奇癢(除豬外)及腦脊髓炎為主癥的急性傳染病。豬的偽狂犬病在我國廣泛存在，危害嚴重，是制約規(guī)模化豬場生產的主要疫病之一。它能引起妊娠母豬流產、死胎或木乃伊胎和仔豬出現神經癥狀、麻痹，死亡率高。PRV具有較強的泛嗜性、神經嗜性及潛伏感染特性，在外周神經系統(tǒng)可以長期潛伏感染，當潛伏病毒被激活變成有感染力的病毒，被潛伏感染的宿主就會發(fā)病。

最近的研究報道稱豬偽狂犬病發(fā)生了新的特點，突出表現為任何年齡的豬都會感染，可在豬群水平傳播，潛伏期短(1～2天)，發(fā)病率在10％～100％之間，發(fā)病豬死亡率在10％～100％之間(仔豬死亡率可高達100％)，感染后可引起豬只高熱(40～42℃，持續(xù)3日以上)，呼吸困難，腹瀉，喘，咳嗽，打噴嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，側臥不起，角弓反張，泳狀劃水，最后衰竭而死，并可引起種公豬精液質量下降，懷孕母豬流產(高達35％)，早產，死胎，弱仔(弱仔14日齡前全部死亡)等繁殖障礙癥狀。現有技術的疫苗免疫豬只后不能完全抵抗野毒攻擊，依然會出現高熱，精神沉郁，食欲下降或廢絕等癥狀，感染率超過80％，發(fā)病率超過30％，死亡率在10％～20％之間(參見豬偽狂犬病病毒新流行株的分離鑒定及抗原差異性分析.彭金美等.中國預防獸醫(yī)學報，2013，35(1)：1-4；免疫后發(fā)病仔豬中偽狂犬病毒的分離和鑒定.童武等.中國動物傳染病學報，2013,21(3):1-7；PathogenicPseudorabies Virus,China,2012.Yu et al.,Emerging infectious Diseases.2014,20(1):102-104；Pseudorabies virus variant in Bartha-K61-vaccinated pigs,China,Anet al.,Emerging infectious Diseases.2013.19(11)：1749-1755，臨床上需要針對豬偽狂犬變異株引起的偽狂犬病的疫苗。

預防和控制豬偽狂犬變異株引起的偽狂犬病有效的方法是疫苗接種，開發(fā)商品化的疫苗可以是滅活疫苗，也可以是弱毒株制備的活疫苗。然而，滅活疫苗成本較高，活疫苗一般是通過基因工程手段人工缺失毒力基因致弱毒株來制備的，存在生物安全風險。因此，臨床上存在提供安全性高的弱毒疫苗株以預防豬偽狂犬變異株感染蔓延的需要。

發(fā)明內容

為解決上述問題，本發(fā)明通過細胞傳代、結合誘變劑誘變的方式，自然致弱毒株，使其在自然進化過程中發(fā)生變異，達到完全適應自然環(huán)境條件，以保證該致弱株的穩(wěn)定性，不存在生物安全方面的風險。

本發(fā)明的一個方面在于提供一種豬偽狂犬病病毒的自然致弱毒株，其中，所述豬偽狂犬病病毒的自然致弱毒株TK基因的101～102位發(fā)生1個堿基的插入。本發(fā)明的弱毒株為自然致弱，生物安全性好，不存在毒力返強的風險。

本發(fā)明的一個方面在于提供一種豬偽狂犬病病毒的致弱方法，所述方法包括：(1)培養(yǎng)胸腺激酶缺陷傳代細胞，同步加入5-溴-2’-脫氧尿苷(BUdR)，形成良好單層；(2)將豬偽狂犬病病毒接種生長良好的上述傳代細胞單層，同步加入BUdR，繼續(xù)傳代培養(yǎng)至所述豬偽狂犬病病毒傳代8代以上，得到所述的豬偽狂犬病病毒弱毒株。

本發(fā)明的一個方面在于提供一種疫苗組合物，所述疫苗組合物含有免疫量的所述豬偽狂犬病病毒的自然致弱毒株或其培養(yǎng)物，以及藥學上可以接受的載體。