[發(fā)明專利]一種豬偽狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗組合物和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611249230.7
• 申請(qǐng)日: 2016-12-29
• 公開（公告）號(hào): CN108251383A
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 田克恭;李向東;譚菲菲;孫進(jìn)忠;張?jiān)S科
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 普萊柯生物工程股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N7/00
• 分類號(hào): C12N7/00;C12N7/08;A61K39/245;A61P31/22
• 代理公司: 北京華夏正合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11017
• 代理人: 韓登營(yíng)

1.一種豬偽狂犬病病毒的自然致弱毒株，其中，以豬偽狂犬病病毒HN1201株的TK基因?yàn)榛鶞?zhǔn)，所述豬偽狂犬病病毒的自然致弱毒株TK基因101～102位之間發(fā)生1個(gè)堿基的插入；優(yōu)選地，所述插入的堿基為C。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬偽狂犬病病毒的自然致弱毒株，其中，所述豬偽狂犬病病毒為豬偽狂犬病病毒變異株，所述豬偽狂犬病病毒變異株包括HN1201株、HN1202株、HN1201-R株；所述豬偽狂犬病病毒HN1201株的自然致弱毒株為HN1201-TK[101-C-102nt]⁺株，所述豬偽狂犬病病毒HN1202株的自然致弱毒株為HN1202-TK[101-C-102nt]⁺株，所述豬偽狂犬病病毒HN1201-R株的自然致弱毒株為HN1201-R2株。

3.一種疫苗組合物，所述疫苗組合物包括免疫量的所述HN1201-R2株或其培養(yǎng)物，和藥學(xué)上可接受的載體。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗組合物，其中，所述HN1201-R2株的培養(yǎng)物為傳代1～102代的培養(yǎng)物。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗組合物，其中，所述HN1201-R2株含量為≥10^6.0TCID₅₀/頭份；優(yōu)選地，所述HN1201-R2株含量為10^6.0TCID₅₀/頭份～10^7.0TCID₅₀/頭份。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗組合物，其中，所述藥學(xué)上可接受的載體包括穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑包括SPGA、糖類、蛋白質(zhì)，含有蛋白質(zhì)的物質(zhì)，或緩沖液；糖類包括山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖，蛋白質(zhì)包括白蛋白或者酪蛋白，所述含有蛋白質(zhì)的物質(zhì)包括牛血清或脫脂乳，所述緩沖液包括磷酸鹽緩沖液。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物進(jìn)一步包括免疫量的其他抗原，所述其他抗原包括豬瘟病毒抗原、豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原、豬圓環(huán)病毒抗原、副豬嗜血桿菌抗原、豬肺炎支原體抗原、豬細(xì)小病毒抗原、豬乙型腦炎病毒抗原；優(yōu)選地，所述其他抗原包括豬瘟病毒抗原、豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原、豬圓環(huán)病毒抗原和/或副豬嗜血桿菌抗原或豬肺炎支原體抗原。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物進(jìn)一步包括佐劑，所述佐劑包括弗氏完全和不完全佐劑、維生素E、非離子嵌段聚合物、胞壁酰二肽、ISCOMs、皂苷、礦物油、植物油或Carbopol。

9.權(quán)利要求1所述豬偽狂犬病病毒的自然致弱毒株的制備方法，其中，所述方法包括：

步驟(1)取生長(zhǎng)良好的143TK^-細(xì)胞，用胰酶消化，接種于細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，以含有90％～97％體積比的DMEM培養(yǎng)液、3％～10％體積比的胎牛血清和50μg/ml 5-溴-2’-脫氧尿苷的細(xì)胞培養(yǎng)液，所述細(xì)胞培養(yǎng)液pH為7.0～8.0，在36℃～38℃，5％CO₂條件下繼續(xù)培養(yǎng)，形成單層143TK^-細(xì)胞；

步驟(2)接種豬偽狂犬病病毒HN1201株到所述步驟(1)培養(yǎng)的單層143TK^-細(xì)胞，用含有50μg/ml BUdR及95％～99％體積比的DMEM培養(yǎng)液和1％～5％體積比的胎牛血清的細(xì)胞維持液，所述細(xì)胞維持液pH為7.1～7.5，在36℃～38℃，5％CO₂條件下繼續(xù)培養(yǎng)，在68h～72h后，當(dāng)細(xì)胞80％以上發(fā)生病變時(shí)，收獲感染病毒的細(xì)胞及上清液，-80℃反復(fù)凍融3次后，收獲病毒；以及

步驟(3)按照所述步驟(2)的方法再傳7代，然后將收獲的病毒接種于143TK^-細(xì)胞，用含50μg/ml 5-溴-2’-脫氧尿苷的低熔點(diǎn)瓊脂糖平皿培養(yǎng)，所述低熔點(diǎn)瓊脂糖平皿由含4％胎牛血清的2×DMEM與2％瓊脂糖按照體積比1:1混合而成，待出現(xiàn)蝕斑后，挑取單個(gè)蝕斑到DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

10.權(quán)利要求3～8所述的疫苗組合物在制備預(yù)防和治療豬偽狂犬病病毒感染相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述的豬偽狂犬感染相關(guān)疾病是由豬偽狂犬病病毒變異株導(dǎo)致的豬偽狂犬病。