[發(fā)明專利]一種抗鏈球菌溶血素O快速診斷試劑盒及其使用方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611248706.5
• 申請(qǐng)日: 2016-12-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106855571A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-06-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳立國(guó);鄒偉權(quán);張亞麗;李慶祥;母潤(rùn)紅;王濤;蘇焱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州華弘生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/536
• 分類號(hào): G01N33/536;G01N21/31
• 代理公司: 北京精金石專利代理事務(wù)所(普通合伙)11470
• 代理人: 劉曄

1.一種抗鏈球菌溶血素O快速診斷試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包含樣本處理液、反應(yīng)緩沖液、膠體金標(biāo)記穩(wěn)定液、標(biāo)準(zhǔn)品、清洗液。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗鏈球菌溶血素O快速診斷試劑盒，其特征在于，所述的膠體金標(biāo)記穩(wěn)定液為含2～8％(w/v)三羥甲基甲胺基乙磺酸、0.02～0.1％(w/v)疊氮化鈉、0.1～0.2％(w/v)吐溫-20、2～6％(w/v)海藻酸鈉、1～2％(w/v)甘氨酸的膠體金標(biāo)記鏈球菌溶血素O溶液。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗鏈球菌溶血素O快速診斷試劑盒，其特征在于，所述的膠體金標(biāo)記鏈球菌溶血素O溶液的制備包括以下步驟：

(1)膠體金的制備：

①取100mL質(zhì)量濃度為0.01％的四氯金酸水溶液與1mL聚乙二醇4000混合，加熱至沸騰，保持沸騰3min，在1000r/min攪拌速度下，迅速加入2mL還原劑溶液，在攪拌下繼續(xù)加熱，直至溶液變成成橘紅色為止，冷卻，即得膠體金溶液；

②取20mL含25mmol/L EDTA，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75％的蔗糖溶液置于50mL的離心管中，然后加入10mL含25mmol/L EDTA，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50％的蔗糖溶液，靜置10min，然后取10mL步驟①制得的膠體金溶液緩慢加入到離心管中，平衡后在4℃，2000r/min離心15～20min，收集處于75％的蔗糖與50％的蔗糖界面中的膠體金，即得；

(2)膠體金標(biāo)記鏈球菌溶血素O溶液的制備：

①鏈球菌溶血素O用量確定：取1mL步驟(1)制得的膠體金，使用0.1mol/L的醋酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.5～8.5，加入0.1mL 10％的氯化鈉溶液，混勻，然后加入不同體積的鏈球菌溶血素O溶液，混勻，靜置1h，觀察是否有顏色改變或沉淀析出，當(dāng)出現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象，表明加入的鏈球菌溶血素O的用量不足，當(dāng)無(wú)顏色改變且無(wú)沉淀析出，表明加入的鏈球菌溶血素O的用量為制備膠體金標(biāo)記鏈球菌溶血素O溶液所需的鏈球菌溶血素O穩(wěn)定用量；

②膠體金標(biāo)記鏈球菌溶血素O溶液的制備：取10mL步驟(1)制得的膠體金，使用0.1mol/L的醋酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.5～8.5，加入1mL 10％的氯化鈉溶液，加入10倍步驟①確定的制備膠體金標(biāo)記鏈球菌溶血素O溶液所需的鏈球菌溶血素O穩(wěn)定用量，混勻，反應(yīng)10min，然后將反應(yīng)液使用Sephadex G-200柱進(jìn)行純化，即得膠體金標(biāo)記鏈球菌溶血素O溶液。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗鏈球菌溶血素O快速診斷試劑盒，其特征在于，所述步驟(1)膠體金的制備中還原劑溶液的制備為：取10mL質(zhì)量濃度為1％的抗壞血酸、6mL質(zhì)量濃度為1％的鞣酸、1mL 0.2mol/L碳酸氫鉀溶液和2mL雙蒸水，混合，即得。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗鏈球菌溶血素O快速診斷試劑盒，其特征在于，所述的反應(yīng)緩沖液組成為：4～12％(w/v)2-(N-嗎啡啉)乙磺酸、2～4％(w/v)BSA、0.1～0.2％(w/v)吐溫-20、0.01～0.1％(w/v)疊氮化鈉、1～2％(w/v)乙二醇和2～8％(w/v)PEG6000。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗鏈球菌溶血素O快速診斷試劑盒，其特征在于，所述的樣本處理液為含有0.05～0.1％(w/v)乙二胺四乙酸鈉、0.5～1％(v/v)Triton X-100、0.05～0.1％(w/v)Proclin 300、且濃度為0.05mol/L、pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗鏈球菌溶血素O快速診斷試劑盒，其特征在于，所述的清洗液組為含0.1％(w/v)吐溫-20、0.1mol/L氯化鈉，且濃度為0.05mol/L、pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗鏈球菌溶血素O快速診斷試劑盒，其特征在于，所述的標(biāo)準(zhǔn)品的制備為：

使用含0.1mol/L氯化鈉、2％(w/v)BSA，pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液將鏈球菌溶血素O抗體配制成濃度分別為5，25，50，125，250，500ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)液，即得。

9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的抗鏈球菌溶血素O快速診斷試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)取2.5μL校準(zhǔn)品，加入150μL反應(yīng)緩沖液，混勻，于37℃恒溫5min，然后向混合體系中加入30μL膠體金標(biāo)記穩(wěn)定液，混勻，于37℃恒溫5min，空白管調(diào)零，在檢測(cè)波長(zhǎng)為540±10nm、檢測(cè)溫度為37℃的條件下測(cè)定吸光度，根據(jù)不同濃度校準(zhǔn)品測(cè)得的吸光度值和相應(yīng)的濃度值制定標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(2)取2.5μL待測(cè)樣品，按照步驟(1)的條件進(jìn)行吸光度測(cè)定，將測(cè)得的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)應(yīng)的濃度值即為待測(cè)物的濃度。